Anak seorang dokter, Eugène Nicolle, yang aktif di RS Rouen, dan darinya Charles muda belajar biologi. Pindah ke Paris untuk belajar di Institut Pasteur, setelah selesai ia kembali ke Rouen pada tahun 1896 untuk bekerja di laboratorium bakteriologi yang ada di RS setempat.
Pada tahun 1903 ia diangkat sebagai direktur di Lembaga Pasteur, jabatan yang dipegang hingga akhir hayatnya pada tahun 1936, dan selama inilah ia mengadakan penelitian di Tunisia.
Selama hidupnya, Nicolle menulis sejumlah buku non-fiksi dan bakteriologi,termasuk Le Destin des Maladies infectieuses; La Nature, Conception et morale biologiques; Responsabilités de la Médecine, dan La Destinée humaine.