Hartline meneliti respon listrik retinaarthropoda, vertebrata, dan moluska tertentu karena sistem penglihatannya lebih sederhana daripada manusia sehingga lebih mudah dipelajari. Ia memusatkan studinya pada matabelangkas (Limulus polyphemus). Menggunakan elektrode menit dalam percobaannya, ia mendapatkan rekaman pertama atas impuls listrik yang dikirimkan oleh serabut nervus opticus tunggal ketika reseptor yang terhubung kepadanya dirangsang dengan cahaya. Ia menemukan bahwa sel fotoreseptor mata terhubung satu sama lain dengan cara demikian yang bila salah satu terangsang, sel lain yang berdekatan tertekan, sehingga mempertinggi kontras dalam pola cahaya dan mempertajam persepsi bentuk. Kemudian Hartline menyusun pemahaman terperinci atas kerja fotoreseptor perseorangan dan serabut saraf di retina, dan ia menunjukkan seberapa sederhananya mekanisme retina menyusun langkah vital dalam penggabungan informasi penglihatan.