Fils d’un soldat du maréchal Oudinot, Isidore Pils manifesta tôt ses talents. Vers 1826, il entre dans l'atelier de Guillaume Guillon Lethière, auprès duquel il étudie son art pendant quatre ans. Il est également l'élève de François Édouard Picot (1786-1868).
Il est lauréat du prix de Rome de 1838 dans la catégorie peinture d’histoire avec Saint Pierre guérissant un boiteux à la porte du Temple, puis il effectue son séjour à l’Académie de France à Rome à la villa Médicis, alors dirigée par Ingres.
De santé fragile, tuberculeux, il part en convalescence à Ischia pendant l’été 1839. Pendant son séjour en Italie il visite Naples, Venise et Florence. Ses premières peintures sont d’inspiration religieuse.
Suivant les troupes françaises en Crimée ou en Orient de 1854 à 1855, il commence à s’orienter vers la peinture militaire. Son œuvre la plus célèbre est Rouget de L'Isle chantant pour la première fois la Marseillaise en 1792, chez Dietrich à Strasbourg. Ce tableau fut terminé en 1849. Resté lié au maréchal Oudinot, il réalisa plusieurs portraits de ce dernier — dont une esquisse du maréchal sur son lit de mort —, le plus connu de ces portraits se trouvant au musée de l'Armée à Paris.
En 1860, il partage son atelier parisien avec le peintre Alfred de Dreux. Il envoie son tableau La Fête donnée à l’Empereur et à l’Impératrice à Alger en 1860 à l’Exposition universelle de 1867.
Il peint de nombreuses scènes militaires pendant le siège de Paris par les Prussiens en 1871. Il est choisi pour exécuter une partie du plafond du grand escalier de l’Opéra de Paris.
Au moment de sa mort en 1875, ses dernières paroles exhortent les peintres à travailler « d’après la nature »[réf. nécessaire]. Il est inhumé au cimetière du Père-Lachaise (54e division).
↑La date du , généralement reprise, est étayée par la trace administrative officielle de son dossier de Légion d'honneur (en ligne), mais contredit la date de naissance du donnée par Raoul de Cisternes dans la préface du Journal de marche du grenadier Pils publié en 1895, œuvre de son père François Pils. Or, l'état-civil reconstitué de la Ville de Paris donne également la date de 1815, plus plausible effectivement car François Pils était pris dans la retraite de Russie en 1812. C'est également la date gravée sur sa tombe.
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