Lahir di Athena, ia adalah putra dari mantan Perdana Menteri Yunani dan presiden Demokrasi Baru, Konstantinos Mitsotakis, dan istrinya Marika (née Giannoukou). Pada saat kelahirannya, keluarganya telah ditempatkan di bawah tahanan rumah oleh junta militer Yunani yang telah menyatakan ayahnya sebagai persona non grata dan memenjarakannya pada malam kudeta.[1] Pada tahun 1968, ketika dia baru berusia enam bulan, keluarganya melarikan diri ke Turki dengan bantuan Menteri Luar Negeri Turki saat itu İhsan Sabri Cağlayangil. Setelah beberapa saat, mereka pindah dari Turki ke Paris dan menunggu sampai tahun 1974 untuk kembali ke Yunani setelah demokrasi dipulihkan.[2] Kemudian, Mitsotakis menggambarkan enam bulan pertama hidupnya sebagai pemenjaraan politik.[3]
Pada tahun 1986, ia lulus dari Athens College. Dari 1986 hingga 1990, ia kuliah di Universitas Harvard dan memperoleh gelar sarjana dalam studi sosial, menerima Hadiah Hoopes. Dari tahun 1992 hingga 1993 ia kuliah di Universitas Stanford, mendapatkan gelar Master Ford Dorsey dalam Kebijakan Internasional. Dari 1993 hingga 1995, ia menghadiri Sekolah Bisnis Universitas Harvard, di mana ia memperoleh gelar MBA.[4]