Культивування клітин — це фундаментальна техніка в галузі біотехнології, яка передбачає культивування та розмноження клітин поза їх природним середовищем, як правило, у контрольованих лабораторних умовах. Цей метод здійснив революцію в різних науковихдисциплінах і галузях, уможлививши поглиблені дослідження, розробку ліків, тканинну інженерію та біовиробництво.
Історія
Концепція вирощування клітин поза їх природним середовищем бере свій початок з кінця XIX століття. У 1906 році американський зоолог Росс Гаррісон досяг значної віхи, успішно культивувавши нервові клітиниембріонажаби в сольовому розчині, продемонструвавши потенціал для росту клітин у штучних умовах.[1] Подібним чином у 1911 році Алексіс Каррель, французький хірург, розвинув цю сферу завдяки своїй новаторській роботі з культивування клітин. Він розробив метод «курячого серця», який передбачав використання ембріональних тканин для створення першої успішної довготривалої клітинної культури.[2]
На початку 20-го століття розробка відповідних культуральних середовищ і стерильних методів проклала шлях для більш систематичних експериментів з культурою клітин. Розробка Гаррі Іглом у 1950-х роках мінімально необхідного середовища Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) стала важливою віхою, забезпечивши чітку та збалансовану суміш поживних речовин, придатну для широкого діапазону типів клітин.[3] Крім того, удосконалення асептичних методів Говардом Ґріном у 1970-х роках значно покращило здатність підтримувати вільні від контамінації клітинні культури.[4]
Клітинна культура охоплює різноманітний набір типів клітин, починаючи від первинних клітин, отриманих безпосередньо з тканин, до безсмертних клітинних ліній і спеціалізованих клітинних конструкцій. Первинні клітини зберігають свої характеристики ближче до свого природного стану, тоді як безсмертні клітинні лінії, такі як клітини HeLa, зазнали генетичних змін, щоб уникнути типового старіння та підтримувати постійне розмноження. Стовбурові клітини та органоїди, які відтворюють складніші структури тканин, пропонують нові шляхи імітації фізіологічного середовища in vitro (від лат.in — в, лат.vitro — скло).[5]
Культуральні середовища
Культуральні середовища забезпечують необхідні поживні речовини та фактори росту, необхідні для виживання та проліферації клітин поза організмом. Формула культуральних середовищ з часом еволюціонувала від простіших поживних сумішей, які використовувалися на початку 20-го століття, до хімічно визначених безсироваткових середовищ, доступних сьогодні. Загальні компоненти культуральних середовищ включають амінокислоти, вітаміни, солі та фактори росту.[6][7][8][9][10]
Умови культивування
Підтримка належних умов культивування має вирішальне значення для здоров’я та росту клітин. Такі фактори, як температура, вологість, рН і концентрація газів (зазвичай CO2 і O2), суворо контролюються, щоб імітувати природне фізіологічне середовище клітин.[11]Інкубатори, оснащені точним контролем, забезпечують оптимальні умови для росту клітин.[12][13]
Клітини звичайно поміщають у скляні посудини, звідси і дослідження отримали назву вивчення in vitro, хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових посудинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі +38 °C +39 °C (для клітин тваринного і людського організмів) та при +22 °C +28 °C (для рослинних клітин) у поживному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії або моношару. Суспензійна культура — це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їх морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром і формою. Метод суспензійної культури може бути застосовано не тільки до клітин тварин, а й до рослинних клітин.
Посудини для культур клітин
Вибір посудини для культури впливає на ріст клітин і результати експерименту. Традиційні посудини включають чашки Петрі, багатолункові планшети та роликові пляшки. Досконаліші варіанти, такі як біореактори[14][15][16] та мікрофлюїдні пристрої[17][18][19][20], забезпечують динамічне культуральне середовище для імітації фізіологічних умов.
Флакони із культуральним середовищем для вирощування тваринних клітин
Під час експерименту. Культивування клітин проводиться у стерильних умовах з відповідними засобами захисту.
У цитології даний метод зручний тим, що клітини в культурі легко доступні для різних біохімічних маніпуляцій. При роботі з ними радіоактивні речовини, отрути, гормони та ін. можуть бути введені у потрібній концентрації протягом необхідного періоду часу. Кількість цих речовин може бути на порядок менше, ніж при експерименті на тварині. Зникає загроза того, що речовина буде метаболізована печінкою, екскретована нирками або відкладеться у м'язах. Це забезпечує отримання реальних значень швидкості дії речовини на клітину або її засвоєння клітиною.
Для дослідження живих рослинних клітин використовують культуру ізольованих протопластів. Ізольовані протопласти можна визначити як «голі» клітини рослин, оскільки клітинна стінка видаляється механічним або ферментативним способом. Система ізольованих протопластів дає можливість вести селекцію на клітинному рівні, працювати у малому об'ємі з великою кількістю індивідуальних клітин, отримувати нові форми рослин шляхом прямого перенесення генів, отримувати соматичні гібриди між віддаленими у систематичному відношенні видами. Оскільки в ізольованих протопластах одразу починається регенерація клітинної оболонки, то вони є зручним об'єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.
У вірусології культури клітин використовуються дуже широко, оскільки з ними порівняно легко працювати у лабораторії, на відміну від інших методів — вирощування вірусів на курячих ембріонах або у організмі живих тварин. Крім того на моношарі клітинної культури можна добре вивчити цитопатичну дію вірусів, за утворенням внутрішньо-клітинних включень, бляшок, у реакціях гемадсорбції й пасивної гемаглютинації та за кольоровою пробою. При роботі з культурами клітин суттєві результати можуть бути отримані при роботі з невеликою кількістю культур. Експерименти, які потребують для підтвердження того чи іншого факту сотні або тисячі лабораторних тварин можуть бути з рівною статистичною достовірністю поставлені на такій же кількості культур клітин. Таким чином при лабораторії не треба тримати віварій і відсутні етичні аспекти поводження з хворими тваринами.
Також вивчається трансформація клітин вірусами, механізм якої подібний до механізму виникнення злоякісних пухлин.
Культури клітин широко застосовуються для тестування дії речовин, які можуть бути використані як лікарські препарати. Попри те, що результати, отримані на культурах клітин не можна екстраполювати на весь організм, не викликає сумніву, що якщо та чи інша речовина порушує діяльність клітин з кількох різних лініях культур, то необхідно очікувати негативного ефекту і при введенні цієї речовини у організм.
Специфічні культури клітин є цінним джерелом гормонів та інших біологічно активних речовин. Вже зараз вони застосовуються для виробництва противірусного білку інтерферону.
Скаффолди (каркаси) діють як опорні структури, які імітують позаклітинний матрикс і забезпечують основу для прикріплення, росту та диференціації клітин. Клітини висівають на ці каркаси за допомогою методів клітинної культури, що дозволяє їм прилипати та розмножуватися, утворюючи тканиноподібні структури.[22] Матеріали скелетів різноманітні, включаючи природні полімери (наприклад, колаген, фібрин), синтетичні полімери (наприклад, полімолочна кислота, полігліколева кислота) і гібридні матеріали для оптимізації механічних і біологічних властивостей.
Диференціація клітин від початкового стану до більш спеціалізованого фенотипу є критичним аспектом тканинної інженерії. Умови культивування клітин, включаючи фактори росту[23], хімічні сигнали[24] та механічні сили[25][24], ретельно контролюються, щоб керувати диференціацією клітин за певними лініями. Маніпулюючи культуральним середовищем, дослідники можуть стимулювати клітини розвиватися в бажані типи клітин, що призводить до формування функціональних тканин.
Останні досягнення в техніці культивування клітин дозволили створювати органоїди — мініатюрні, спрощені версії органів — in vitro.[26][27][28] Ці тривимірні структури формуються за допомогою точних умов культивування клітин, які імітують середовище in vivo. Органоїди повторюють архітектуру та функції певних тканин або органів, забезпечуючи безцінні моделі для вивчення процесів розвитку та механізмів захворювання[29], а також реакції на ліки в персоналізованій медицині[30][31] та розробці нових ліків[32][33][34][35][36]. Крім того, такі органоїди відкривають великі можливості для регенеративної медицини, наприклад, в лікуванніінсульту[37] чи травм голомного мозку[38][21]. (див. такожІнженерія нервової тканини)
Культивоване м’ясо, також відоме як м’ясо, вирощене в лабораторії, м'ясо з пробірки, або м’ясо на клітинній основі, — це інноваційний підхід, який використовує методи культивування клітин для виробництва м’ясних продуктів без традиційного тваринництва. Культура клітин відіграє ключову роль у цій галузі, забезпечуючи ріст і розмноження клітин тварин у контрольованому середовищі.[39][40]
Виробництво культивованого м’яса починається з відбору та ізоляції клітин тварин, як правило, із зразка тканини, отриманого за допомогою біопсії або інших неінвазивних методів. Ці клітини, відомі як «стартерні клітини», служать основою для вирощування культивованого м’яса in vitro. Вони можуть включати м’язовістовбурові клітини (міобласти), які мають потенціал диференціюватися в м’язові волокна, які є основним компонентом м’яса.[41][42]
Методи культивування клітин використовуються для розширення та проліферації початкових клітин у великій кількості, створюючи достатню популяцію клітин для виробництва м’яса. Ці клітини забезпечені ретельно розробленим культуральним середовищем, яке містить поживні речовини, фактори росту та інші важливі компоненти, необхідні для їхнього росту та реплікації.[43]
Щоб отримати м’ясо, текстура якого нагадує м’ясо, вирощене на традиційних фермах, клітини часто культивують у тривимірних структурах, які, як і в тканинні інженерії, називаються каркасами (скаффолдами). Ці каркаси забезпечують підтримку та імітують природний позаклітинний матрикс, спрямовуючи клітини до формування структур, схожих на м’язову тканину. Цей підхід до 3D-культури має вирішальне значення для створення текстури та відчуття у роті, які споживачі асоціюють із м’ясом.[44][45]
Культивовані клітини проходять процес диференціювання, керуючись конкретними умовами культивування та ознаками, щоб перетворитися на зрілі м’язові волокна. Цей процес передбачає злиття клітин, утворюючи більші багатоядерні структури, схожі на м’язову тканину.[46] Для посилення розвитку функціональних м’язових волокон використовується використання різноманітних факторів диференціації та механічної стимуляції.[39][43]
Типи культур клітин
1. Первинно-трипсинізовані — отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином чи іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).
2. Перещеплювані — клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.
3. Напівперещеплювані (диплоїдні) — можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.
Мікробіологія: навчальний посібник для студентів фармацевтичних вищих навчальних закладів і фармацевтичних факультетів вищих медичних навчальних закладів III—IV рівнів акредитації за спеціальністю «клінічна фармація». Дейнека С. Є., Патратій В. К., Сидорчук І. Й. та ін. — Чернівці: Медик, 2004. — 312 с.
↑Zhao, Zixuan; Chen, Xinyi; Dowbaj, Anna M.; Sljukic, Aleksandra; Bratlie, Kaitlin; Lin, Luda; Fong, Eliza Li Shan; Balachander, Gowri Manohari; Chen, Zhaowei (1 грудня 2022). Organoids. Nature Reviews Methods Primers(англ.). Т. 2, № 1. с. 1—21. doi:10.1038/s43586-022-00174-y. ISSN2662-8449. PMC10270325. PMID37325195. Процитовано 16 серпня 2023.{{cite news}}: Обслуговування CS1: Сторінки з PMC з іншим форматом (посилання)
.jpg)
