Криоэлектронная томография

Схема  электронной томографии. Образец наклоняется под разными углами к электронному лучу, в результате "наклона" получаются серии 2D-изображений. Серии изображений с наклоном преобразовываются на компьютере в 3D "томограммы".

Электронная крио-томография (ЭКТ, также  крио-электронная томография, крио-ET или CET) —  способ получения трехмерного изображения с высоким разрешением (~4 нм). Используется для получения изображений  биологических макромолекул и клеток[1].

ЭКТ используется с применением просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), в которой образцы  наклоняются под разными углами к электронному лучу, в результате получаются серии двумерных изображений. Серии двумерных изображений с наклоном обрабатываются на компьютере, в результате получается трёхмерная томограмма.

В отличие от методик, использующих электронную томографию, в данной методике исследуемые образцы замораживают по специальной технологии, так чтобы объект исследования не повредился кристаллами льда, давлением, химическими веществами и прочими факторами. Такая процедура называется криофиксацией. Обычно органический образец охлаждают так, чтобы образовавшийся лёд был аморфным (некристаллическим, т.о. проводят витрификацию)[2], а просвечивание ведётся в криогенных условиях при температурах ниже ${\displaystyle -150}$°С, что препятствует разрушению биологических структур[3].

Описание техники

Пример электронной крио-томографии. На рисунке показана центральная часть томографической реконструкции клетки Bdellovibrio bacteriovorus. Шкала 200 нм.

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы находятся в  глубоком вакууме. Такой вакуум неприменим для биологических образцов, так как в клетках закипает вода и они взрываются.  При комнатной температуре в ЭМ образцы  обезвоживают. Другим подходом к стабилизации биологических образцов, является их заморозка (крио-электронная микроскопия). В  крио-электронной микроскопии, образцы (обычно мелкие клетки (например, бактерии или Археи) или вирусы) подготавливают для исследования в обычных водных средах. Образцы  погружают в криоген (обычно жидкий этан), при этом молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. В результате такого охлаждения вода переходит в состояние аморфного льда.[2] При этом  сохраняются  клеточные структуры, такие как липидные мембраны, которые обычно разрушаются при обычном замораживании. Замороженные образцы хранятся при температуре жидкого азота и вода не прогревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы просматриваются в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ). Они наклоняются под разными углами относительно электронного пучка (обычно каждые 1 или 2 градуса примерно от -60° до +60°), получаются изображения под каждым углом. Серия изображений обрабатывается на компьютере и получается трехмерное изображение интересующего объекта[4]. Полученное изображение называется томограммой или томографической реконструкцией.

Особенности

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) электроны взаимодействуют с материалом образца, поэтому разрешение ограничено его толщиной.  Пробы должны иметь  толщину не менее ~500 нм для достижения “макромолекулярного” разрешение (~4 нм). По этой причине большинство ЭСТ исследований были сосредоточены на изучении очищенных макромолекулярных комплексов, вирусов и мелких клеток, таких как многие виды бактерий и Архей.

Сильное взаимодействие электронов с веществом приводит к эффектам анизотропии.  При наклоне образца электронный луч взаимодействует с относительно большой площадью поперечного сечения. Это приводит к тому, что на практике, углы наклона большие, чем  60—70° не дают много информации и поэтому не используется.

В ЭКТ также применяются  крио-флуоресцентная микроскопия[5],  световая микроскопия (например, крио-Палм[6]) и др. методики. В этих методиках образец, содержащий флуоресцентно-меченый белок  замораживается и просматривается  в световом микроскопе. При этом  образец должен храниться при температурах (ниже -150°С). Флуоресцентный сигнал идентифицируется и образец передается для изучения в крио-ET.

См. также

• Крио-электронная микроскопия
• Электронная микроскопия
• Электронная томография
• Просвечивающая электронная микроскопия

Примечания

1. Gan, Lu; Jensen, Grant J. Electron tomography of cells (неопр.) // Quarterly Reviews of Biophysics. — 2012. — 1 February (т. 45, № 1). — С. 27—56. — ISSN 1469-8994. — doi:10.1017/S0033583511000102. — PMID 22082691.
2. Архивированная копия  (неопр.). Дата обращения: 8 октября 2017. Архивировано 8 октября 2017 года.
3. Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, J. J.; Homo, J. C.; Lepault, J.; McDowall, A. W.; Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens (неопр.) // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1988. — 1 May (т. 21, № 2). — С. 129—228. — ISSN 0033-5835. — doi:10.1017/s0033583500004297. — PMID 3043536.
4. Lučič, Vladan; Rigort, Alexander; Baumeister, Wolfgang. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ (англ.) // The Journal of Cell Biology^[англ.] : journal. — 2013. — 5 August (vol. 202, no. 3). — P. 407—419. — ISSN 1540-8140. — doi:10.1083/jcb.201304193. — PMID 23918936. — PMC 3734081.
5. Zhang, Peijun. Correlative cryo-electron tomography and optical microscopy of cells (англ.) // Current Opinion in Structural Biology : journal. — 2013. — 1 October (vol. 23, no. 5). — P. 763—770. — ISSN 1879-033X. — doi:10.1016/j.sbi.2013.07.017. — PMID 23962486.
6. Chang, Yi-Wei. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography (англ.) // Nature Methods : journal. — 2014. — 1 July (vol. 11, no. 7). — P. 737—739. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2961. — PMID 24813625.

Внешние ссылки

• Getting started in cryo-EM course (Caltech)