|
Авидин
 Авидин представляет собой тетрамерный биотин-связывающий белок, вырабатываемый в яйцеводах птиц, рептилий и амфибий и откладывающийся в белке их яиц. Димерные члены семейства авидинов также обнаружены в некоторых бактериях[1]. В белке куриного яйца авидин составляет примерно 0,05 % от общего белка (примерно 1800 г). мкг на яйцо). Тетрамерный белок содержит четыре идентичные субъединицы (гомотетрамеры), каждая из которых может связываться с биотином (витамин В7, витамин Н) с высокой степенью аффинности и специфичности. Измеренная константа диссоциации авидин-биотинового комплекса составляет KD ≈ 10-15M, что делает его одной из самых прочных известных нековалентных связей[2]. Размер тетрамерной формы авидина оценивается в 66-69 кДа[3]. 10 % молекулярной массы составляют углеводы, состоящие из четырёх-пяти остатков маннозы и трех остатков N-ацетилглюкозамина[4]. Углеводные фрагменты авидина содержат как минимум три уникальных структурных типа олигосахаридов, сходных по структуре и составу[5]. Функциональный авидин содержится только в сыром яйце, так как биотиновое сродство белка разрушается при варке. Естественная функция авидина в яйцах неизвестна, хотя постулируется, что он вырабатывается в яйцеводе в качестве ингибитора роста бактерий путем связывания биотина, полезного для роста бактерий. В качестве доказательства этого можно привести стрептавидин, родственный белок с таким же сродством к биотину и очень похожим сайтом связывания, который вырабатывается некоторыми штаммами бактерий Streptomyces и, как считается, служит для подавления роста конкурирующих бактерий наподобие антибиотика[6]. Из коммерчески доступного продукта была выделена негликозилированная форма авидина; однако неясно, встречается ли негликозилированная форма в природе или является продуктом производственного процесса[7]. Открытие Авидин был открыт Эсмондом Эмерсоном Снеллом (1914—2003). Это открытие началось с наблюдения, что у цыплят на диете из сырого яичного белка наблюдается дефицит биотина, несмотря на наличие витамина в их рационе[8]. Был сделан вывод, что компонент яичного белка связывал биотин[8], что Снелл подтвердил in vitro с помощью анализа на дрожжах[9]. Позже Снелл выделил компонент яичного белка, ответственный за связывание биотина, и в сотрудничестве с Полом Дьердь подтвердил, что изолированный яичный белок был причиной дефицита биотина или «повреждения яичного белка». В то время исследователи из Техасского университета предварительно назвали этот белок авидальбумином (буквально «голодный альбумин»)[9]. Позже название белка было изменено на «авидин» из-за его сродства к биотину (авидин + биотин)[10]. Приложения
Исследования 1970-х годов помогли сделать систему авидин-биотин мощным инструментом биологических наук. Зная о силе и специфичности авидин-биотинового комплекса, исследователи начали использовать куриный авидин и стрептавидин в качестве зондов и матриц сродства в многочисленных исследовательских проектах[11][12][13][14]. Вскоре после этого исследователи Байер и Вилчек разработали новые методы и реагенты для биотинилирования антител и других биомолекул[15][16], что позволило использовать систему авидин-биотин в ряде биотехнологических приложений. Сегодня авидин используется в самых разных областях, от исследований и диагностики до медицинских устройств и фармацевтики. Сродство авидина к биотину используется в широком спектре биохимических анализов, включая вестерн-блоттинг, ELISA, ELISPOT и нисходящие анализы. В некоторых случаях использование биотинилированных антител позволило заменить меченные радиоактивным йодом антитела в системах радиоиммунного анализа, чтобы получить нерадиоактивную систему анализа. Авидин, иммобилизованный на твердых носителях, также используется в качестве очищающей среды для захвата меченого биотином белка или молекул нуклеиновой кислоты. Например, белки клеточной поверхности могут быть специфически помечены биотиновым реагентом, непроницаемым для мембран, а затем специфически захвачены с использованием носителя на основе авидина. Модифицированные формыВ качестве основного заряженного гликопротеина авидин проявляет неспецифическое связывание в некоторых применениях. Нейтравидин, дегликозилированный авидин с модифицированными аргининами, имеет более нейтральную изоэлектрическую точку (pI) и доступен в качестве альтернативы нативному авидину, когда возникают проблемы неспецифического связывания. Дегликозилированные нейтральные формы куриного авидина доступны через Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin) и e-Proteins (NeutraLite). Учитывая прочность авидин-биотиновой связи, диссоциация авидин-биотинового комплекса требует экстремальных условий, вызывающих денатурацию белка. Необратимый характер авидин-биотинового комплекса может ограничивать применение авидина в аффинной хроматографии, где желательно высвобождение захваченного лиганда. Исследователи создали авидин с обратимыми характеристиками связывания за счет нитрования или йодирования тирозина в сайте связывания[17]. Модифицированный авидин проявляет сильные характеристики связывания биотина при рН 4 и высвобождает биотин при рН 10 или выше[17]. Мономерная форма авидина с пониженным сродством к биотину также используется во многих коммерчески доступных аффинных смолах. Мономерный авидин создается обработкой иммобилизованного нативного авидина мочевиной или гуанидином HCl (6-8 М), придающей ему более низкую диссоциацию KD ≈ 10-7 М[18]. Это позволяет элюировать из матрицы авидина в более мягких, неденатурирующих условиях, с использованием низких концентраций биотина или условий с низким pH. Для одного сайта связывания биотина с высокой аффинностью без сшивки можно использовать моновалентную версию дальнего родственника авидина, стрептавидина[19]. Блокирование связывания биотинаТермическая стабильность и биотинсвязывающая активность авидина представляют как практический, так и теоретический интерес для исследователей, поскольку стабильность авидина необычно высока, а авидин является антинутриентом в пище человека[20]. Исследование 1966 года, опубликованное в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications, показало, что структура авидина остается стабильной при температуре ниже 70 °C (158 °F) °С. . Выше 70 °C (158 °F), структура авидина быстро разрушается и к 85 °C (185 °F) обнаруживается обширная потеря структуры и потеря способности связывать биотин[21]. Анализ, проведенный в 1991 году для Journal of Food Science, выявил существенную активность авидина в варёном яичном белке: "средняя остаточная активность авидина в жареном, варёном и варёном (2 минуты) яичном белке составляла 33, 71 и 40 % активности в сыром яичном белке. " Анализ показал, что времени приготовления было недостаточно для адекватного нагревания всех холодных участков в яичном белке. Полная инактивация биотинсвязывающей способности авидина требует кипячения более 4 минут[22]. Исследование 1992 года показало, что термическая инактивация биотинсвязывающей активности авидина была описана D 121 . °C = 25 мин и z = 33 °С. Это исследование противоречило предыдущим предположениям, «что сайт связывания авидина разрушается при тепловой денатурации»[20]. Биотин-связывающие свойства авидина были использованы при разработке идрабиотапаринукса, низкомолекулярного гепарина длительного действия, используемого для лечения венозного тромбоза . Из-за пролонгированного действия идрапаринукса были высказаны опасения по поводу клинического лечения геморрагических осложнений. При добавлении фрагмента биотина к молекуле идрапаринукса образуется идрабиотапаринукс; его антикоагулянтную активность в условиях кровотечения можно отменить путем внутривенного вливания авидина[23]. См. такжеИспользованная литература
Ссылки
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
