Janel Moloney è nata nel sobborgo di Woodland Hills, in California, ed è la nipote dell'attrice Christine Ebersole. Ha frequentato il corso quadriennale di recitazione alla SUNY Purchase.
Durante la campagna presidenziale del 2004 negli Stati Uniti, Moloney è stata un attivo sostenitore della campagna presidenziale di John Kerry e ha fatto apparizioni pubbliche per suo conto.
Il successo arriva nel 1999, con la partecipazione alla serie televisiva West Wing - Tutti gli uomini del Presidente, dove interpretava Donna Moss, assistente del vice-capo del personale della Casa Bianca, Josh Lyman. Originariamente era accreditata come guest-star (pur comparendo in tutti gli episodi della prima stagione). Dalla seconda stagione in poi, è stata inclusa nel cast principale. Per la sua interpretazione ha ricevuto due nomination agli Emmy Award, una nel 2002 e una nel 2004.
Nel 2007, ha fatto il suo debutto Off-Broadway palco del Playwrights Horizons, dove ha interpretato Teresa nella produzione 100 Saints You Should Know, scritto da Kate Fodor e diretto da Ethan McSweeny. È apparsa nella commedia Off-Broadway, Love, Loss, and What I Wore tra settembre e ottobre 2011.
Vita privata
L'attrice si è sposata con il compositore Marcelo Zarvos e il 14 febbraio 2010 è diventata madre di Julian Francesco Zarvos.