Setelah lulus dari Akademi Angkatan Laut Amerika Serikat, Stafford ditugaskan di Angkatan Udara Amerika Serikat, menerbangkan F-86 Sabre sebelum menjadi pilot uji coba. Dia terpilih menjadi astronot pada tahun 1962, dan terbang dengan Gemini 6A pada tahun 1965 dan Gemini 9A pada tahun 1966. Pada tahun 1969, Stafford menjabat sebagai komandan Apollo 10, awak kedua misi untuk mengorbit Bulan dan yang pertama menerbangkan Modul Bulan di orbit bulan, turun ke ketinggian sembilan mil.
Pada tahun 1975, Stafford menjadi komandan penerbangan Apollo-Soyuz Test Project (ASTP), misi luar angkasa gabungan AS-Soviet yang pertama. Seorang brigadir jenderal pada saat itu, ia menjadi perwira jenderal pertama yang terbang di luar angkasa. Dia adalah anggota pertama di kelas Akademi Angkatan Laut yang menyematkan bintang pertama, kedua, dan ketiga dari seorang perwira umum. Dia melakukan enam pertemuan di luar angkasa dan mencatat 507 jam penerbangan luar angkasa.
Pada tahun 1993, Stafford Air & Space Museum didirikan untuk menghormati Stafford di kampung halamannya di Weatherford, Oklahoma. Awalnya hanya dua ruangan, kini telah berkembang menjadi ruang artefak seluas lebih dari 63.000 kaki persegi. Museum ini merupakan afiliasi Smithsonian dan merupakan satu-satunya museum di dunia yang menyimpan mesin uji tembak yang akan digunakan dalam Perlombaan Luar Angkasa: mesin F-1 AS dan mesin NK-33 Soviet. Museum ini juga merupakan rumah bagi pesawat ruang angkasa Gemini 6 yang diterbangkan Schirra dan Stafford dalam pertemuan dengan Gemini 7.
