Pada 19 Mei 1795, Johns Hopkins dilahirkan di Anne Arundel County, Maryland dalam sebuah keluarga kaya. Ia merupakan anak ke-2 dari 11 bersaudara. Ibunya, Hannah Janney, dilahirkan di Loudoun County, Virginia. Ayahnya Samuel Hopkins lahir di Virginia. Kedua orang tuanya menikah pada 19 Agustus1792. Pada saat menikah, Samuel berumur 33 sedangkan Hannah berumur 18 tahun.
The Emansipasi dan akibatnya
Pada 1807, orang tua Johns Hopkins' yang beragama Quaker membebaskan budaknya. Keluarga ini juga merawat budak yang kurang sehat. Sebagai anggota dari komunitas Quaker, orang tuanya merupakan salah satu yang memutuskan untuk mengemansipasikan budak mereka dan juga meminta anggota lainnya yang ingin bergabung dalam komunitas ini melakukan hal yang sama. Karena emansipasi ini pendidikan John dan kakaknya terganggu. Kedua adik-kakak ini harus mengerjakan pekerjaan perkebunan setelah balik dari sekolah. Johns juga terbiasa untuk menolong merawat adik-adiknya. Johns Hopkins juga membantu ibunya ketika ayahnya meninggal pada 1814.
Ibunya meninggal pada 1846, setahun setelah anak tertua mereka Joseph yang juga meninggal. Dia juga banyak membantu saudara-saudaranya yang sudah tua atau memiliki kesulitan finansial.
Tahun bisnis
Setelah dia meninggalkan perkebunan, Hopkins bekerja di bisnis grosiran pamannya. Bisnis sukses pertamanya datang ketika pamannya pergi Perang 1812.
Ketika tinggal di rumah pamannya, dia jatuh cinta kepada sepupunya, Elizabeth Hopkins. Dalam Quakers penilaian terhadap perkawinan antara sepupu sangat kuat dan orang tua Elizabeth tidak mengizinkan mereka untuk menikah. Mereka berjanji tak akan menikah kepada orang lain dan tetap melajang selama hidup mereka. Sama dengan anggota keluarga yang lain, Johns juga menyediakan rumah untuk Elizabeth pada masa tuanya. Elizabeth hidup sampai kematiannya pada 1889, hampir 15 tahun setelah kematian Johns.
Setelah dia meninggalkan bisnis pamannya, Hopkins dan Benjamin Moore, juga seorang Quaker, menjalankan bisnis bersama. Bisnis tersebut kemudian menjadi Hopkins & Brothers ketika Moore membatalkan kerja sama mereka dan menyatakan bahwa Johns mencintai uang lebih daripadanya.