Pichia pastoris

? Pichia pastoris
Біологічна класифікація
Царство: Fungi Тип: Ascomycota Клас: Saccharomycetes Ряд: Saccharomycetales Родина: Saccharomycetaceae Рід: Pichia / Komagataella Вид: pastoris
Біноміальна назва
Pichia pastoris
Посилання
MB: 303634 IF: 303634

Pichia pastoris — вид метилотрофних дріжджів. Він був знайдений у 1960-х роках, з його особливістю використовувати метанол як джерело вуглецю та енергії.[1] Після багатьох років досліджень P. pastoris широко використовувався в біохімічних дослідженнях і біотехнологічній промисловості. В останнє десятиліття деякі звіти перевіднесли P. pastoris до роду Komagataella за допомогою філогенетичного аналізу шляхом секвенування геному P. pastoris. Рід був розділений на K. phaffii, K. pastoris і K. pseudopastoris.[2][3]

P. pastoris в природі

Природне середовище проживання

У природі P. pastoris зустрічається на деревах, наприклад на каштанах. Вони є гетеротрофами і можуть використовувати кілька джерел вуглецю для життя, наприклад глюкозу, гліцерин і метанол.[4] Однак вони не можуть використовувати лактозу.

Розмноження

P. pastoris може зазнавати як безстатевого, так і статевого розмноження шляхом брунькування та аскоспор.[5] У цьому випадку існує два типи клітин P. pastoris : гаплоїдні та диплоїдні клітини. У нестатевому життєвому циклі гаплоїдні клітини піддаються мітозу для розмноження. Під час статевого циклу диплоїдні клітини піддаються споруляції та мейозу.[6] Швидкість росту його колоній може коливатися в широкому діапазоні: від майже долі секунди, до часу подвоєння в одну годину, що активно використовується для промислових процесів.[7]

P. pastoris як модельний організм

В останні кілька років P. pastoris було досліджено та визначено як хороший модельний організм із кількома перевагами. Перш за все, P. pastoris можна легко вирощувати та використовувати в лабораторії. Як і інші широко використовувані моделі дріжджів, він має відносно короткий життєвий цикл та гарну здатність до регенерації. Більше того, розроблено деякі недорогі культуральні середовища, щоб P. pastoris міг швидко рости на них із високою щільністю клітин.[8] Було виконано повне секвенування генома P. pastoris. Геном P. pastoris GS115 був секвенований Інститутом біотехнології Фландрії та Університетом Гента та опублікований у Nature Biotechnology.[9] Послідовність генома та анотацію гена можна переглянути за допомогою системи ORCAE. Повні геномні дані дозволяють вченим ідентифікувати гомологічні білки та еволюційні зв'язки між іншими видами дріжджів і P. pastoris. Крім того, P. pastoris є одиночними еукаріотичними клітинами, що означає, що дослідники можуть досліджувати білки всередині P. pastoris. Тоді можливе гомологічне порівняння з іншими більш складними еукаріотичними видами.[10]

Ще однією перевагою P. pastoris є його схожість з добре вивченою моделлю дріжджів — Saccharomyces cerevisiae. Як модельний організм для біології S. cerevisiae добре вивчався протягом десятиліть і використовувався дослідниками для різних цілей протягом історії. Два роди дріжджів; Pichia та Saccharomyces мають схожі умови росту; таким чином, культура P. pastoris може бути прийнята лабораторіями без значних модифікацій.[11] Зважаючи на всі переваги, P. pastoris можна з користю використовувати як генетичну та експериментальну модель організму.

P. pastoris як експериментальний модельний організм

Як експериментальний модельний організм P. pastoris в основному використовувався як мішень для трансформації. Завдяки його здатності до рекомбінації з чужорідною ДНК і обробки великих білків було проведено багато досліджень, щоб дослідити можливість виробництва нових білків і функції штучно створених білків, використовуючи P. pastoris для трансформації геному відповідним чином.[12] В останнє десятиліття P. pastoris було удосконалено для створення систем експресії.

Перевага

1: P. pastoris здатний рости на простому, недорогому середовищі з високою швидкістю росту. P. pastoris можна вирощувати як у колбах для струшування, так і у ферментері, що робить його придатним як для дрібно-, так і для великомасштабного виробництва.[13]

2: P. pastoris має два гени алкогольоксидази, Aox1 і Aox2, які включають сильно індуцибельні промотори.[14] Ці два гени дозволяють Pichia використовувати метанол як джерело вуглецю та енергії. Промотори АОХ індукуються метанолом і пригнічуються глюкозою. Зазвичай ген потрібного білка вводять під контролем промотору Aox1, що означає, що продукцію білка можна індукувати додаванням метанолу в середовище. Після кількох досліджень вчені виявили, що промотор, отриманий з гена AOX1 у P. pastoris, надзвичайно підходить для контролю експресії чужорідних генів, які були трансформовані в геном P. pastoris, продукуючи гетерологічні білки.[15]

3: Завдяки ключовій рисі P. pastoris може рости в культурі з надзвичайно високою щільністю клітин. Ця властивість сумісна з гетерологічною експресією білка, що дає більший вихід продукції.[16]

4: Технологія, необхідна для генетичних маніпуляцій P. pastoris, подібна до технології Saccharomyces cerevisiae, яка є одним із найбільш добре вивчених дріжджових модельних організмів. Як наслідок, протокол експерименту та матеріали легко створити для P. pastoris.[17]

Недолік

Деяким білкам для належного згортання потрібен шаперонін, але Pichia не здатна виробляти ряд білків, оскільки P. pastoris не містить відповідних шаперонів. Технології впровадження генів шаперонінів ссавців у геном дріжджів і надекспресії існуючих шаперонінів ще потребують вдосконалення.[18][19]

Біотерапевтичне виробництво

За останні кілька років Pichia pastoris використовувалася для виробництва понад 500 видів біотерапевтичних засобів, таких як IFNγ (Інтерферон гамма). На початку одним недоліком цієї системи експресії білка було надмірне глікозилювання з високою схожістю до структури залишку манози, що є потенційною причиною імуної відповіді.[20][21] У 2006 році дослідницькій групі вдалося створити новий штам під назвою YSH597. Цей штам може експресувати еритропоетин у його нормальній формі глікозилювання(така ж як у ссавців).[22]

Виробництво ферментів для харчової промисловості

У харчовій промисловості, наприклад, на пивоварнях та пекарнях, Pichia pastoris використовується для виробництва різних ферментів, харчових добавок з багатьма функціями. Наприклад, деякі ферменти, які виробляє генетично модифікована Pichia pastoris, можуть зберегти м'якість хліба. Тим часом у пивоварнях використовують ферменти для зниження концентрації алкоголю.[23]

Примітки

1. Koichi Ogata, Hideo Nishikawa & Masahiro Ohsugi (1969). A Yeast Capable of Utilizing Methanol. Agricultural and Biological Chemistry. 33 (10): 1519—1520. doi:10.1080/00021369.1969.10859497.
2. De Schutter, K., Lin, Y., Tiels, P. (2009). Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 27 (6): 561—566. doi:10.1038/nbt.1544. PMID 19465926.
3. Heistinger, Lina; Gasser, Brigitte; Mattanovich, Diethard (1 липня 2020). Microbe Profile: Komagataella phaffii: a methanol devouring biotech yeast formerly known as Pichia pastoris. Microbiology (англ.). 166 (7): 614—616. doi:10.1099/mic.0.000958. ISSN 1350-0872. PMID 32720891.
4. Rebnegger, C., Vos, T., Graf, A. B., Valli, M., Pronk, J. T., Daran-Lapujade, P., & Mattanovich, D. (2016). Pichia pastoris exhibits high viability and a low maintenance energy requirement at near-zero specific growth rates. Applied and Environmental Microbiology. 82 (15): 4570—4583. Bibcode:2016ApEnM..82.4570R. doi:10.1128/AEM.00638-16. PMC 4984280. PMID 27208115.
5. Kurtzman (1998). 42 - Pichia E.C. Hansen emend. Kurtzman. The Yeasts: A Taxonomic Study. 1: 273—352. doi:10.1016/B978-044481312-1/50046-0. ISBN 9780444813121.
6. Zörgö E, Chwialkowska K, Gjuvsland AB, Garré E, Sunnerhagen P, Liti G, Blomberg A, Omholt SW, Warringer J (2013). Ancient Evolutionary Trade-Offs between Yeast Ploidy States. PLOS Genetics. 9 (3): e1003388. doi:10.1371/journal.pgen.1003388. PMC 3605057. PMID 23555297.
7. Kastilan, R., Boes, A., Spiegel, H. (2017). Improvement of a fermentation process for the production of two PfAMA1-DiCo-based malaria vaccine candidates in Pichia pastoris. Nature. 1 (1): 7. Bibcode:2017NatSR...711991K. doi:10.1038/s41598-017-11819-4. PMC 5607246. PMID 28931852.
8. M. M. Guarna G. J. Lesnicki B. M. Tam J. Robinson C. Z. Radziminski D. Hasenwinkle A. Boraston E. Jervis R. T. A. MacGillivray R. F. B. Turner D. G. Kilburn (1997). On‐line monitoring and control of methanol concentration in shake‐flask cultures of Pichia pastoris. Biotechnology and Bioengineering. 56 (3): 279—286. doi:10.1002/(SICI)1097-0290(19971105)56:3<279::AID-BIT5>3.0.CO;2-G. PMID 18636643.
9. De Schutter K, Lin YC, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Lehmann J, Rouzé P, Van de Peer Y, Callewaert N (June 2009). Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 27 (6): 561—6. doi:10.1038/nbt.1544. PMID 19465926.
10. Brigitte Gasser, Roland Prielhofer, Hans Marx, Michael Maurer, Justyna Nocon, Matthias Steiger, Verena Puxbaum, Michael Sauer & Diethard Mattanovich (2013). Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiology. 8 (2): 191—208. doi:10.2217/fmb.12.133. PMID 23374125.
11. Tran, A., Nguyen, T., Nguyen, C. (2017). Pichia pastoris versus Saccharomyces cerevisiae: a case study on the recombinant production of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. BMC Res Notes. 10 (1): 148. doi:10.1186/s13104-017-2471-6. PMC 5379694. PMID 28376863.
12. Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y., & Madden, K. R. (1985). Pichia pastoris as a host system for transformations. Molecular and Cellular Biology. 5 (12): 3376—3385. doi:10.1128/MCB.5.12.3376. PMC 369166. PMID 3915774.
13. Wenhui Zhang Mark A. Bevins Bradley A. Plantz Leonard A. Smith Michael M. Meagher. (2000). Modeling Pichia pastoris growth on methanol and optimizing the production of a recombinant protein, the heavy‐chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A. Biotechnology and Bioengineering. 70 (1): 1—8. doi:10.1002/1097-0290(20001005)70:1<1::AID-BIT1>3.0.CO;2-Y. PMID 10940857.
14. Daly R, Hearn MT (2005). Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. Journal of Molecular Recognition. 18 (2): 119—38. doi:10.1002/jmr.687. PMID 15565717.
15. Romanos, Mike. (1995). Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene expression. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5): 527—533. doi:10.1016/0958-1669(95)80087-5.
16. Zhou, X., Yu, Y., Tao, J., & Yu, L. (2014). Production of LYZL6, a novel human c-type lysozyme, in recombinant Pichia pastoris employing high cell density fed-batch fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering . 118 (4): 420—425. doi:10.1016/j.jbiosc.2014.03.009. PMID 24745549.
17. Morton, C. L., & Potter, P. M. (2000). Comparison of Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperda, and COS7 cells for recombinant gene expression. Molecular Biotechnology. 16 (3): 193—202. doi:10.1385/MB:16:3:193. PMID 11252804.
18. Bankefa, OE; Wang, M; Zhu, T; Li, Y (July 2018). Hac1p homologues from higher eukaryotes can improve the secretion of heterologous proteins in the yeast Pichia pastoris. Biotechnology Letters. 40 (7): 1149—1156. doi:10.1007/s10529-018-2571-y. PMID 29785668.
19. Yu, Xiao-Wei; Sun, Wei-Hong; Wang, Ying-Zheng; Xu, Yan (24 листопада 2017). Identification of novel factors enhancing recombinant protein production in multi-copy Komagataella phaffii based on transcriptomic analysis of overexpression effects. Scientific Reports. 7 (1): 16249. Bibcode:2017NatSR...716249Y. doi:10.1038/s41598-017-16577-x. PMC 5701153. PMID 29176680.
20. Razaghi A, Tan E, Lua LH, Owens L, Karthikeyan OP, Heimann K (January 2017). Is Pichia pastoris a realistic platform for industrial production of recombinant human interferon gamma?. Biologicals. 45: 52—60. doi:10.1016/j.biologicals.2016.09.015. PMID 27810255.
21. Ali Razaghi; Roger Huerlimann; Leigh Owens; Kirsten Heimann (2015). Increased expression and secretion of recombinant hIFNγ through amino acid starvation-induced selective pressure on the adjacent HIS4 gene in Pichia pastoris. European Pharmaceutical Journal. 62 (2): 43—50. doi:10.1515/afpuc-2015-0031.
22. Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S, Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi BK, Hopkins D, Wischnewski H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J, Wildt S, Gerngross TU (September 2006). Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins. Science. 313 (5792): 1441—3. Bibcode:2006Sci...313.1441H. doi:10.1126/science.1130256. PMID 16960007.
23. Spohner, S. C., Müller, H., Quitmann, H., & Czermak, P. (2015). Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. Journal of Biotechnology. 202: 420—425. doi:10.1016/j.jbiotec.2015.01.027. PMID 25687104.