Штучна бактеріальна хромосома

Бактеріальна штучна хромосома (bacterial artificial chromosome, BAC ) - це ДНК-конструкція, розроблена на основі плазміди функціональної фертильності (або F-плазміди ), що використовується для трансформації та клонування бактерій, як правило, E. coli. [1] [2] [3] Вибір F-плазміди зумовлений тим, що вона містить гени розподілу, які сприяють рівномірному розходженню плазмід після поділу бактеріальної клітини. Зазвичай розмір вставки для бактеріальної штучної хромосоми становить 150–350 тисяч пар основ . [4] Подібний клонувальний вектор, що називається PAC, також було розроблено на основі ДНК бактеріофага P1.

BAC часто використовуються для секвенування геному організмів у геномних проектах, наприклад, в проекті "геном людини" . Короткі частини ДНК організму ампліфікуються, як вставки в BAC, а потім секвенуються. Після цього, секвеновані частини збирають in silico, отримуючи в результаті геномну послідовність організму. BACs були замінені більш швидкими і менш трудомісткими методами секвенування, такими як повногеномне секвенування методом дробовика, а останнім часом і методами секвенування нового покоління (next generation sequencing).

Типові компоненти в складі BAC

repE

для реплікації плазміди та регулювання кількості її копій.

parA і parB

для розподілу плазмідної ДНК на дочірні клітини під час поділу та стабільне підтримання її вмісту в клітинах.

Селективний маркер

для антибіотикорезистентності ; деякі BAC також мають ген β-галактозидази (lacZ) в сайті клонування для біло-синього скринінгу .

T7 & Sp6

фагові промотори для транскрипції вставлених генів.

Використання для моделювання хвороб

Спадкові захворювання

Зараз BAC використовуються більшою мірою для моделювання генетичних захворювань, часто разом з використанням трансгенних мишей. BAC можуть бути корисними у таких дослідженнях, оскільки складні гени іноді мають декілька регуляторних елементів перед кодуючою послідовністю, зокрема різні промоторні послідовності, що регулюватимуть рівень експресії гена. BAC з певним успіхом використовували при вивченні на мишах неврологічних захворювань, таких як хвороба Альцгеймера або у дослідженні анеуплоїдії, пов’язаної з синдромом Дауна. Були також дослідження, де їх застосовували для вивчення конкретних онкогенів, пов’язаних з раком. При моделюванні генетичних захворювань BAC з відповідною вставкою доставляється в модельний організм шляхом електропорації/трансформації, трансфекції відповідним вірусом або за допомогою мікроін'єкцій. BAC також можна застосовувати для виявлення генів або великих послідовностей, а потім використовувати їх для картування на хромосомі людини за допомогою BAC-мікрочипів. Перевагою BAC у дослідженнях такого роду є те, що вони вміщують набагато більші за довжиною послідовності без ризику їх перебудови, і тому є більш стійкими, ніж інші типи клонувальних векторів.  

Інфекційні захворювання

Геноми кількох великих ДНК-вірусів та РНК-вірусів були клоновані в BAC. Такі конструкції називають "інфекційними клонами", оскільки трансфекція BAC-вектору в клітини-господарі є достатньою для ініціювання вірусної інфекції. Інфекційна властивість цих BAC зробила доступнішим вивчення багатьох вірусів, таких як герпесвіруси, поксвіруси та коронавіруси[5][6][7]. Молекулярні дослідження цих вірусів тепер можна проводити, використовуючи генетичні методи для здійснення мутацій в BAC, поки вона знаходиться в бактеріях. У таких методах використовують лінійні або кільцеві таргетні вектори для проведення гомологічної рекомбінації[8].

Примітки

1. O'Connor M, Peifer M, Bender W (June 1989). Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910): 1307—12. doi:10.1126/science.2660262. PMID 2660262.
2. Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (September 1992). Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18): 8794—7. doi:10.1073/pnas.89.18.8794. PMC 50007. PMID 1528894.
3. Shizuya H, Kouros-Mehr H (March 2001). The development and applications of the bacterial artificial chromosome cloning system (PDF). The Keio Journal of Medicine. 50 (1): 26—30. doi:10.2302/kjm.50.26. PMID 11296661.
4. Stone NE, Fan JB, Willour V, Pennacchio LA, Warrington JA, Hu A, de la Chapelle A, Lehesjoki AE, Cox DR, Myers RM (March 1996). Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Research. 6 (3): 218—25. doi:10.1101/gr.6.3.218. PMID 8963899.
5. Almazán F, González JM, Pénzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Durán J, Enjuanes L (May 2000). Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10): 5516—21. doi:10.1073/pnas.97.10.5516. PMC 25860. PMID 10805807.
6. Domi A, Moss B (September 2002). Cloning the vaccinia virus genome as a bacterial artificial chromosome in Escherichia coli and recovery of infectious virus in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (19): 12415—20. doi:10.1073/pnas.192420599. PMC 129459. PMID 12196634.
7. Messerle M, Crnkovic I, Hammerschmidt W, Ziegler H, Koszinowski UH (December 1997). Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26): 14759—63. doi:10.1073/pnas.94.26.14759. PMC 25110. PMID 9405686.
8. Feederle R, Bartlett EJ, Delecluse HJ (December 2010). Epstein-Barr virus genetics: talking about the BAC generation. Herpesviridae. 1 (1): 6. doi:10.1186/2042-4280-1-6. PMC 3063228. PMID 21429237.