РНК-полімераза

РНК-полімераза клітини T. aquaticus в процесі реплікації. Деякі елементи ферменту зроблені прозорими, і ланцжки РНК і ДНК видно виразніше. Іон магнію (жовтий) розташований на активній ділянці ферменту.

РНК-полімераза — фермент, що здійснює синтез молекул РНК. У вузькому сенсі, РНК-полімеразою зазвичай називають ДНК-залежні РНК-полімерази, що здійснюють синтез молекул РНК на матриці ДНК, тобто здійснюють транскрипцію. Ферменти класу РНК-полімераз дуже важливі для функціювання клітини, тому вони є у всіх організмах і в багатьох вірусах. Хімічно РНК-полімерази є нуклеотиділ-трансферазами, що полімеризують рибонуклеотиди на 3'-кінці ланцюжка РНК.

Історія дослідження

РНК-полімераза була відкрита незалежно Семом Вайссом і Джерардом Хурвіцем в 1960 році[1]. До цього моменту Нобелівська премія з фізіології і медицини в 1959 році вже була присуджена Северо Очоа і Артуру Корнбергу за відкриття речовини, яку вважали РНК-полімеразою[2], що згодом виявилася рибонуклеазою.

Нобелівська премія з хімії в 2006 році була присуджена Роджеру Корнбергу за отримання точних зображень молекул РНК-полімерази в різні моменти процесу транскрипції[3].

Керування транскрипцією

Електронна мікрофотографія ланцюжків ДНК, обліплених сотнями молекул РНК-полімерази, дуже маленьких для такої роздільної здатності прилада. Кожна РНК-полімераза транскрибує один ланцюжок РНК, видимий на фотографії як відгалуження від ДНК. Відміткою «Begin» вказаний 5'-кінець ДНК, з якого РНК-полімераза починає транскрипцію; «End» — 3'-кінець, у якого транскрипція довших молекул РНК завершується.

Керування процесом транскрипції генів дозволяє контролювати експресію генів і таким чином дозволяє клітині адаптуватися до змін умов зовнішнього середовища, підтримувати метаболічні процеси на належному рівні, а також виконувати специфічні функції, необхідні для існування організму. Не дивно, що дія РНК-полімерази дуже складна і залежить від безлічі факторів (так, у Escherichia coli ідентифіковано більше 100 факторів, що тим або іншим способом впливають на РНК-полімеразу[4]).

РНК-полімераза починає транскрипцію з особливих ділянок ДНК, які називаються промоторами, і синтезує ланцюжок РНК, комплементарний відповідній частині ланцюга ДНК.

Процес нарощування молекули РНК нуклеотидами називається елонгацією. У еукаріотичних клітинах РНК-полімераза може збирати ланцюжки довжиною більше 2,4 млн елементів (наприклад, таку довжину має повний ген білка дистрофіну).

РНК-полімераза завершує формування ланцюжка РНК, коли зустрічає в ДНК специфічну послідовність, що називається термінатором.

РНК-полімераза синтезує такі типи РНК:

• Матрична РНК (мРНК) — шаблон для синтезу білків в рибосомах.
• Некодуюча РНК або «РНК-ген» — великий клас генів, що кодують РНК, на яких не може бути побудовано білок. Найвідоміші представники цього класу — транспортна РНК (тРНК) і рибосомна РНК (рРНК), що самі беруть участь в процесі синтезу білка. Проте, починаючи з пізніх 90-х років 20 століття було виявлено багато інших РНК-генів. Це дало можливість припустити, що РНК-гени відіграють значнішу роль в клітці, ніж вважалось раніше.
  • Транспортна РНК (тРНК), що переносить амінокислоти до білкового ланцюжка, що росте на рибосомі, під час процесу трансляції.
  • Рибосомна РНК (рРНК), що входить до складу рибосоми;
  • МікроРНК, що регулює активність генів;
  • Каталітична РНК, що має властивості ферментів.

РНК-полімераза здійснює синтез з нуля. Це можливо внаслідок того, що взаємодія початкового нуклеотиду гена і РНК-полімерази дозволяє їй закріпитися на ланцюжку і приєднатись до наступних нуклеотидів. Це частково пояснює, чому РНК-полімераза зазвичай починає транксріпцию з аденіну, за яким слідує гуанін, урацил і потім цитозин. На відміну від ДНК-полімерази РНК-полімеразі притаманна також геліказна активність, що не потребує додаткових ферментів для розкручування спіралі ДНК.

Дія РНК-полімерази

Зв'язування і ініціація транскрипції

В зв'язуванні РНК-полімерази бере участь α-субодиниця, що розпізнає елемент ДНК, який передує гену (-40…-70 кроків), і σ-фактор, ділянка, що розпізнає елемент на позиціях −10…-35. Існує велика кількість σ-факторов, які контролюють експресію генів. Наприклад: σ^70, який синтезується в нормальних умовах і дозволяє РНК-полімеразі зв'язуватися з генами, що відповідають за метаболічні процеси клітини; або σ^32, що блокує зв'язування РНК-полімерази з генами білків теплового шоку.

Після зв'язування з ДНК, структура РНК-полімерази перетворюється із закритої у відкриту. Це перетворення включає розділення моноспіралей ДНК з утворенням розкрученої ділянки довжиною близько 13 нуклеотидів. Рибонуклеотиди потім збираються в ланцюжок відповідно до базового ланцюгу ДНК, яка використовується як шаблон. Суперскрученість молекул ДНК відіграє важливу роль в активності РНК-полімерази: оскільки ділянка ДНК перед РНК-полімеразою розкручена, в ній існують позитивні компенсаційні супервитки. Ділянки ДНК позаду РНК-полімерази знову закручуються і в них присутні негативні супервитки.

Елонгація

Під час елонгаційної фази транскрипції відбувається додавання рибонуклеотидів до ланцюжка і перехід структури РНК-полімеразного комплексу від відкритої до транскрипційної. У міру збірки молекули РНК, ділянка ДНК перед РНК-полімеразою розкручується далі, і 13-парний відкритий комплекс перетворюється на 17-парний комплекс транскрипції. У цей момент промотор (ділянка ДНК −10…-35 нуклеотидів^[джерело?]) завершується, і σ-фактор відділяється від РНК-полімерази. Це дозволяє РНК-полімеразному комплексу почати рух вперед, оскільки σ-фактор утримував його на місці.

17-парний комплекс транскрипції містить гібрид ДНК і РНК, що містить 8 пар нуклеотидів — 8-крокову ділянку РНК, сполучену з шаблонним ланцюжком ДНК. У міріу виконання транскрипції, рибонуклеотиди додаються до 3'-кінця збираної РНК, і РНК-полімеразний комплекс рухається ланцюжком ДНК. Хоча в РНК-полімеразі не виявлено властивостей, характерних для 3'-екзонуклеази, аналогічних перевірочній діяльності ДНК-полімерази, є свідоцтва того, що деякі РНК-полімерази зупиняються і коректують помилки у випадках помилкового формування пар нуклеотидів ДНК-РНК.

Додавання рибонуклеотидів до РНК має механізм, дуже близький до полімеризації ДНК. Вважається, що ДНК- і РНК-полімерази можуть бути еволюційно пов'язані. Аспарагінові залишки в РНК-полімеразі зв'язуються з іонами Mg^2+, які, у свою чергу, здійснюють вирівнювання фосфатних груп рибонуклеотидів: перший Mg^2+ утримує α-фосфат нуклеотидтрифосфату, що підлягає додаванню в ланцюжок. Це дозволяє здійснити зв'язування нуклеотида з 3' OH-групою кінця збираного ланцюжка і таким чином додати НТФ в ланцюжок. Другий Mg^2+ утримує пірофосфат НТФ. Загальне рівняння реакції таким чином має вигляд:

(НМФ)_n + НТФ --> (НМФ)_n+1 + ПФ_i

Термінація

Термінація транскрипції РНК може бути ρ-незалежною або ρ-залежною.

ρ-незалежна термінація здійснюється без допомоги ρ-фактора. Транскрипція паліндромної ділянки ДНК призводить до формування шпильки з РНК, яка зациклена і зв'язана сама на себе. Ця шпилька багата на гуанін і цитозин, що робить її стабільнішою, ніж гібрид ДНК-РНК. В результаті 8-парний гібрид ДНК-РНК в комплексі транскрипції скорочується до 4-парного. У випадку, якщо ці 4 останніх пари нуклеотидів ссформовані слабкими аденіном і уридином, молекула РНК відділяється. [5].

Бактеріальна РНК-полімераза

У бактерій один і той самий фермент каталізує синтез трьох типів РНК: мРНК, рРНК і тРНК.

РНК-полімераза — чимала молекула. Основний фермент містить 5 субодиниць (~400 кДа):

• α₂: дві α-субодиниці зв'язують решту елементів ферменту і розпізнають регулюючі чинники. Кожна субодиниця складається з двох доменів: αСКД (С-кінцевий домен) зв'язує перший елемент промотора, і αNКД (N-кінцевий домен) зв'язується з рештою компонентів полімерази.
• β: ця субодиниця має власне полімеразну дію, тобто каталізує синтез РНК. Вона здійснює ініціацію процесу і керує елонгацією.
• β': неспецифічно зв'язується з ДНК.
• ω: відновлює денатуровану РНК-полімеразу назад в дієздатну форму in vitro. Також виявлено її захисна/шаперонна дія на β'-субодиницю у Mycobacterium smegmatis.

Для зв'язування з промоторними областями ДНК, основний фермент потребує ще одну субодиницю — сігма (σ). Сігма-фактор значно знижує спорідненість РНК-полімерази до неспецифічних областей ДНК, і в той же час підвищує її чутливість до певних промоторів, залежно від своєї структури. З його допомогою транскрипція починається з потрібної ділянки ДНК.

Повний голофермент таким чином складається з 6 субодиниць: α₂ββ'σω (~480 кДа).

У структурі РНК-полімерази присутня канавка 55 Å завдовжки (5,5 нм) і 25 Å завширшки (2,5 нм). Саме у цю канавку поміщається подвійна спіраль ДНК, що має ширину 20 Å (2 нм). На довжині канавки укладається 16 нуклеотидів.

Молекули РНК-полімерази не плавають вільно в цитоплазмі. Коли РНК-полімераза не використовується, вона зв'язується з неспецифічними областями ДНК в очікуванні відкриття активного промотора.

Транскрипційні кофактори

Існують білки, що зв'язуються з РНК-полімеразою і впливають на її поведінку. Наприклад greA і greB з E. coli підсилюють здатність РНК-полімерази розщіпляти шаблон РНК з кінця ланцюжка, що росте. Таке розщеплення може «врятувати» застряглу молекулу РНК-полімерази, а також, ймовірно, бере участь в усуненні помилок збірки ланцюга РНК.

Окремий кофактор Mfd задіяний в транскрипційному відновленні ДНК. Під час цього процесу РНК-полімераза виявляє пошкоджені ділянки ДНК і привертає інші ферменти для її відновлення.

Багато інших кофакторів мають регулюючий вплив, примушуючи РНК-полімеразу експресувати або не експресувати певні гени.

РНК-полімераза в еукаріотичних клітинах

Головна субодиниця РНК-полімераз-I, II і III у людини

Еукаріоти мають різні типи РНК-полімераз, що класифікуються за типами РНК, які вони синтезують:

• РНК-полімераза I, що синтезує 45S-попередника рРНК, що перетворюється потім на рРНК 28S, 18S і 5,8S, які вже утворюють головні РНК-секції рибосоми[6].
• РНК-полімераза II, що синтезує попередників для мРНК, а також для більшості мяРНК і міРНК[7]. Це найкраще вивчений тип РНК-полімерази. З огляду на те, що транскрипція повинна відбуватися під строгим контролем, РНК-полімеразі II для зв'язування з промоторами потрібний цілий набір факторів транскрипції.
• РНК-полімераза III, що синтезує тРНК, 5S рРНК та інші малі РНК, присутня в ядрі і цитозолі[8].

Існують також і інші типи РНК-полімерази, що використовуються в мітохондріях і хлоропластах.

РНК-полімераза у архей

Археї використовують один вид РНК-полімерази, який проте дуже схожий на три основні типи РНК-полімераз у еукаріотів. Деякі вчені припускають, що архейна РНК-полімераза в певному наближенні може бути еволюційним предком спеціалізованих еукаріотичних полімераз[9].

РНК-полімераза у вірусів

РНК-полімераза вірусу Т7, що синтезує мРНК (показана зеленим) з шаблонної ДНК. Білок показаний фіолетовою стрічкою. Зображення взяте з PDB 1MSW.

Багато вірусів містять РНК-полімеразу. Мабуть, найкраще вивчена вірусна РНК-полімераза бактеріофагу Т7. Ця РНК-полімераза, що складається з однієї субодиниці, схожа на мітохондріальну і хлоропластну, а також на ДНК-полімеразу[10].

Вважається, що більшість вірусних полімераз походять від ДНК-полімерази, а не від складних багатокомпонентних РНК-полімераз.

Вірусні полімерази дуже різноманітні. Деякі з них можуть використовувати як шаблон РНК, а не ДНК, як, наприклад, у вірусів з дволанцюжковою РНК або з одноланцюжковою РНК зі зворотною послідовністю. Деякі віруси з одноланцюжковою РНК з прямою послідовністю також містять РНК-залежні РНК-полімерази[11].

Функціональні області

C'-кінцевий домен РНК-полімерази

Ініціювання транскрипції

Домен, розташований на карбоксильному кінці РНК-полімерази II здійснює ініціацію транскрипції ДНК. C'-кінцевий домен зазвичай складається з порядка 52 повторення послідовності Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser[12].

Фактор транскрипції TFIIH, що є кіназою, гіперфосфорилюрує C'-кінцевий домен РНК-полімерази, тим самим примушуючи полімеразний комплекс почати рух від місця ініціації транскрипції.

5'-кеппінг

Домен карбоксильного кінця також є місцем зв'язування з комплексом кеп-синтезу і кеп-зв'язування. У еукаріотів після збірки 5'-кінця РНК, кеп-синтезуючий комплекс відщеплює гамма-фосфат від 5'-фосфата і приєднує до нього гуанозинмонофосфат з утворенням 5',5'-трифосфатного зв'язку. Синтезуючий комплекс потім відділяється і шапочка з ГТФ зв'язується з кеп-зв'язуючим комплексом, який у свою чергу зв'язаний з C'-кінцевим доменом РНК-полімерази. Шапочка на 5'-кінці еукаріотичних РНК важлива для зв'язування молекул РНК з рибосомами або з РНК-полімеразою, а також запобігає руйнуванню РНК.

Сплайсосома

Вуглекисло-кінцевий домен РНК-полімерази також є областю зв'язування з сплайсосомними факторами, що беруть участь в процесі сплайсингу РНК. Ці фактори сприяють здійсненню сплайсинга і видалення інтронів в процесі транскрипції РНК.

Мутація в C'-кінцевому домені

Проведено ряд досліджень поведінки РНК-полімерази при видаленні визначених амінокислот з її C'-кінцевого домену. Показано, що мутації усікання C'-кінцевого домену РНК-полімерази II впливають на її здатність починати транскрипцію набору генів in vivo, знижуючи чутливість до активаційних послідовностей цих генів.

Очищення РНК-полімерази

РНК-полімераза може бути виділена такими способами:

• На фосфоцелюлозній колонці[13].
• За допомогою гліцеринового градієнтного центрифугування[14].
• З використанням колонки ДНК.
• На іонообмінній колонці[15].

А також комбінаціями вищезгаданих методів.

Див. також

• ДНК-полімераза
• РНК-полімераза вірусу Т7
• Альфа-аманітин

Примітки

1. Jerard Hurwitz (Dec 2005). The Discovery of RNA Polymerase. Journal of Biological Chemistry. 280 (52): 42477—85. doi:10.1074/jbc.X500006200. PMID 16230341.
2. Nobel Prize 1959
3. Nobel Prize in Chemistry 2006
4. Akira Ishihama (2000). Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase. 54: 499—518. PMID 11018136.
5. Farnham PJ; Platt T. (Feb 1981). Rho-independent termination: dyad symmetry in DNA causes RNA polymerase to pause during transcription in vitro. Nucleic Acids Res. 9 (3): 563—77. PMID 7012794.
6. Grummt I. (1999). Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 62: 109—54. PMID 9932453.
7. Lee Y; Kim M; Han J; Yeom KH; Lee S; Baek SH; Kim VN. (Oct 2004). MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20): 4051—60. PMID 15372072.
8. Willis IM. (Feb 1993). RNA polymerase III. Genes, factors and transcriptional specificity. Eur J Biochem. 212 (1): 1—11. PMID 8444147.
9. D Langer, J Hain, P Thuriaux and W Zillig (1995) Transcription in Archaea: Similarity to that in Eucarya PNAS 92 5768-5772
10. Hedtke et al. (1997) Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis. Science 227 809—811
11. Paul Ahlquist (2002) RNA-Dependent RNA Polymerases, Viruses, and RNA Silencing. Science 296 1270—1273
12. Anton Meinhart1; Patrick Cramer (Jul 2004). Recognition of RNA polymerase II carboxy-terminal domain by 3-RNA-processing factors. Nature. 430 (6996): 223—226. doi:10.1038/nature02679. PMID 15241417.
13. Kelly JL; Lehman IR. (Aug 1986). Yeast mitochondrial RNA polymerase. Purification and properties of the catalytic subunit. J Biol Chem. 261 (22): 10340—7. PMID 3525543.
14. Honda A та ін. (Apr 1990). Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8. J Biochem (Tokyo). 107 (4): 624—8. PMID 2358436. {{cite journal}}: Явне використання «та ін.» у: |author= (довідка)
15. Hager et al. (1990) Use of Mono Q High-Resolution Ion-Exchange Chromatography To Obtain Highly Pure and Active Escherichia coli RNA Polymerase Biochemistry 29 7890-7894

• Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, David L. Nelson & Michael M. Cox

Посилання

• DNAi — DNA Interactive: інформація и Flash-роліки про РНК-полімеразу.