Dustin Hoffman ville först bli pianist och studerade musik på Santa Monica City College. 1956 avbröt han sina studier och började ta skådespelarundervisning på Pasadena Playhouse. Där träffade han för första gången Gene Hackman. 1958 flyttade han till New York och studerade på Actors Studio. Sin första roll fick han i Gertrude SteinsYes Is For a Very Young Man. Han debuterade i Hollywood 1967 och fick sitt stora genombrott i sin andra filmroll, som Benjamin Braddock i Mandomsprovet. Han nominerades till en Oscar för sin rollprestation.
Han följde upp med filmer där han blev känd för att ta sig an utmaningar och akribiskt förbereda sig för roller. Han spelade bland annat Ratzo Rizzo i Midnight Cowboy (1969) och tillsammans med Steve McQueen i Papillon (1973). År 1976 spelade han Carl Bernstein i Alla presidentens män, som handlar om Watergateaffären. Han mottog sin första Oscar 1980 för rollen som ensamstående far i dramat Kramer mot Kramer (1979). Han fick en stor publikframgång med filmen Tootsie 1982. Han fick sin andra Oscar 1989 för rollen som den autistiske Raymond i Rain Man (1988). Under 1980-talet var han bara med i fem filmer.
År 1996 grundade Dustin Hoffman produktionsfirman Punch Productions. Bland bolagets projekt hör satirfilmen Wag the Dog (1997).
Privatliv
Dustin Hoffman var gift med skådespelaren Anne Byrne mellan 1969 och 1980. Han adopterade hennes dotter från ett tidigare äktenskap och de fick även en gemensam dotter, född 1970.
Han gifte sig med affärskvinnan Lisa Gottsegen 1980, med vilken han fick två söner och två döttrar, födda 1981, 1983, 1984 och 1987.