Геликаз-зависимая амплификация

Гелика́з-зави́симая амплифика́ция (англ. helicase-dependent amplificatio, HDA), также гелика́за-зави́симая изотерми́ческая амплифика́ция, — это метод амплификации ДНК in vitro (подобно полимеразной цепной реакции), который осуществляется при постоянной температуре.

Введение

Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым методом амплификации ДНК in vitro для целей молекулярной биологии и биомедицинских исследований[1]. Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одноцепочечную (этап денатурации, обычно достигаемый при 95-97 °C), отжиг праймеров к одноцепочечной ДНК (этап отжига) и копирование одноцепочечной ДНК для создания новой двухцепочечной ДНК (этап удлинения, для которого требуется ДНК-полимераза), что требует проведения реакции в термоциклере. Эти настольные машины большие, дорогие и требуют больших затрат на эксплуатацию и обслуживание, что ограничивает потенциальное применение амплификации ДНК в ситуациях вне лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте расследования или при оказании помощи пациенту). Хотя ПЦР обычно ассоциируется с термоциклированием, в оригинальном патенте Mullis et al. раскрыто использование геликазы в качестве средства для денатурации двуцепочечной ДНК, что включает изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот. В естественных условиях ДНК реплицируется ДНК-полимеразами с различными вспомогательными белками, включая ДНК-геликаз, которые действуют для разделения ДНК путём раскручивания двойной спирали ДНК[2]. HDA был разработан на основе этой концепции, используя геликаз (фермент) для денатурации ДНК.

Методология

Нити двухцепочечной ДНК сначала разделяются ДНК-геликазой и покрываются одноцепочечной ДНК (ssDNA)-связывающими белками. На втором этапе два праймера, специфичные для конкретной последовательности, гибридизуются с каждой границей шаблона ДНК. Затем ДНК-полимеразы используются для удлинения праймеров, отжигаемых на шаблонах, для получения двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем используются в качестве субстратов ДНК-геликазами, вступая в следующий раунд реакции. Таким образом, развивается одновременная цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной целевой последовательности (схему см. в Vincent et al., 2004[3]).

Современный прогресс, преимущества и недостатки HDA

С момента публикации своего открытия технология HDA используется для «простого, легко адаптируемого теста на нуклеиновые кислоты для выявления Clostridium difficile»[4]. Другие применения включают быстрое обнаружение золотистого стафилококка путём амплификации и обнаружения короткой последовательности ДНК, специфичной для этой бактерии. Преимущества HDA в том, что он обеспечивает быстрый метод амплификации нуклеиновой кислоты специфической мишени при изотермической температуре, не требующий использования термоциклера. Однако исследователю требуется предварительная оптимизация праймеров, а иногда и буферов. Обычно оптимизация праймеров и буферов проверяется и достигается с помощью ПЦР, что ставит вопрос о необходимости дополнительных затрат на отдельную систему для проведения собственно амплификации. Несмотря на то, что HDA не требует использования термоциклера и, следовательно, позволяет проводить исследования в полевых условиях, большая часть работы, необходимой для выявления потенциально опасных микроорганизмов, проводится в исследовательских/больничных лабораториях. В настоящее время массовая диагностика по большому количеству образцов ещё не может быть достигнута с помощью HDA, в то время как ПЦР-реакции, проводимые в термоциклере, вмещающем многолуночные планшеты для образцов, позволяют амплифицировать и обнаружить целевую ДНК-мишень максимум из 96 образцов. Затраты на приобретение реагентов для HDA также относительно дороже, чем на реагенты для ПЦР, тем более что они поставляются в виде готового набора.

См. также

Примечания

  1. ↑ Saiki RK, et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487—491. doi:10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.
  2. ↑ DNA Replication, 2nd edn. — WH Freeman and Company: New York, 1992. — ISBN 978-1-891389-44-3.
  3. ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (2004). "Helicase-dependent isothermal DNA amplification". EMBO Rep. 5 (8): 795—800. doi:10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID 15247927.
  4. ↑ Chow WH, McCloskey C, Tong Y, Hu L, You Q, Kelly CP, Kong H, Tang YW, Tang W (2008). "Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic Clostridium difficile". J Mol Diagn. 10 (5): 452—8. doi:10.2353/jmoldx.2008.080008. PMC 2518740. PMID 18669881.
  5. ↑ United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support

Ссылки