Dopo aver svolto le prove presso i Cantieri del Muggiano, nei suoi primi mesi di servizio il sommergibile fu impegnato a La Spezia nell'addestramento, sotto il controllo del locale Comando Militare Marittimo[1].
Dal 24 marzo al 4 settembre 1917 l'unità operò nel Tirreno settentrionale per difendere le rotte mercantili in quella zona[1]. In questo periodo il Pacinotti effettuò in tutto 13 missioni tra La Maddalena, Livorno e Portoferraio, trascorrendo 926 ore in mare[1].
Il 7 settembre 1917 fu dislocato in Sicilia agli ordini del Comando Marina dell'isola e venne adibito a pattugliamenti antisommergibile: svolse dieci missioni di questo tipo al largo di Lipari, Ustica, Palermo, Messina, Trapani e Favignana[1]. Nel corso di tali missioni il Pacinotti operò insieme alla «nave civetta» Malamocco, un grosso motoveliero di 300 tsl, disarmato, che avrebbe dovuto fungere da esca per unità nemiche[2].
Il 20 dicembre 1917 tornò a La Spezia e fu immesso in cantiere per lavori di manutenzione che si protrassero sino al febbraio del 1919, a guerra finita[1].
Dislocato a La Maddalena, dal febbraio al 4 giugno 1919 operò in funzione addestrativa in acque sarde[1].