Valery Sergueïévitch Zolotoukhine naît le dans le village de Bystry Istok, dans le kraï de l'Altaï.
Il finit les cours de l'Académie russe des arts du théâtre (RATI, futur GITIS) en 1963 et est immédiatement invité au théâtre Mossovet (Soviet de la ville de Moscou, soit l'ancienne Mairie de Moscou). Valery y travaille une année.
Valery fait ses débuts au cinéma en 1965. Il interprète le rôle de Trofimov, soldat de l'Armée rouge, dans la comédie d'aventure de Vladimir Alexandrovitch Nazarov, Le Paquet, d'après la nouvelle de Léonid Pantéléïev. Ce premier rôle révèle Zolotoukhine au grand public et lui assure le début de la célébrité.
À la fin des années 1960, il multiplie les rôles au cinéma. Il obtient ses plus grands succès dans son interprétation du commissaire de quartier Seriozhkine, dans la trilogie: Le maître de la taïga (1969), La perte du témoin (1971) et L'enquête préalable (1973), ainsi que dans la comédie musicale Boumbarache (1972) ou le mélodrame Conte sur la manière dont le Tsar Pierre 1er maria son nègre (1976).
En 2003 il devient directeur artistique du Théâtre d'État de la jeunesse de l'Altaï.
Le il est élu député de la 5e représentation de la Chambre basse du Parlement de Russie ou Douma, sur la liste du parti Russie juste. Mais il transmet son mandat au jeune député Konstantin Viktorovitch Bestchetnov (1975), lors de sa prise de fonction le .
En 2009 il double un des héros principaux du film d'animation Numéro 9.
Le , en accord avec Zolotoukhine lui-même, le directeur du Théâtre de la Taganka détermine la fin de sa fonction de directeur artistique au . Mais il est finalement reconduit pour une année supplémentaire.
Valery est l'auteur de quelques livres de souvenirs, et notamment d'une biographie de Vladimir Vyssotski.
Selon les nouvelles fournies par le système d'information RBC, Valery Zolotoukhine ne travaille plus depuis . Il est hospitalisé à plusieurs reprises, et une tumeur du cerveau est décelée. Il souffre par ailleurs de la maladie d'Alzheimer. Le l'acteur est hospitalisé dans l'unité de soins intensifs de l'Institut de radiologie de Moscou. Il est plongé dans un coma artificiel le .
Il décède le des suites de la maladie. Une cérémonie d'adieu est organisée le au Théâtre de la Taganka. Selon ses dernières volontés il est enterré au cimetière du Temple de la Sainte Vierge, dans son village natal.
1965 : Les Morts et les Vivants, mise en scène de Iouri Lioubimov : « les fatales années quarante », Moussa Djamil, interprètes de chansons et de la ballade À propos de dix grognards d'un poète allemand anti-fasciste méconnu
1972 : Sous la peau de la statue de la liberté, d'Evgueni Evtouchenko, mise en scène de Iouri Lioubimov : un étudiant, représentation de Raskolnikov, un étudiant songeur
1973 : Camarade, crois..., mise en scène de Iouri Lioubimov : pour Pouchkine
