CRISPR/Cas12b-Methode

Die CRISPR/Cas12b-Methode ist eine biochemische Methode um DNA zu schneiden. Sie ist eine Variante der CRISPR/Cas-Methode unter Verwendung der Endonuklease Cas12b.

Prinzip

Cas12b (alter Name C2c1, ein Cas des Typs V, Klasse II) bindet wie andere Cas-Proteine (Cas9, Cpf1) eine RNA mit einer crRNA repeat-Sequenz und einer crRNA spacer-Sequenz und schneidet in der unmittelbaren Umgebung doppelsträngige DNA unter Erzeugung eines sticky end-Doppelstrangbruchs. Weitere notwendige Faktoren sind das Vorhandensein einer tracrRNA und ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) in der zu schneidenden Ziel-DNA. Die auf die von Cas12b gebundene crRNA repeat-Sequenz folgende crRNA spacer-Sequenz bindet an die Ziel-DNA.

Typen

Cas12b aus Alicyclobacillus acidoterrestris, abgekürzt AacCas12b, besteht aus 1129 Aminosäuren und bindet an eine PAM der Sequenz TTN in der Ziel-DNA.[1] Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5′-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem non-target-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem target-Strang.[1] Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C,[1] das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C.[2] Bei 37 °C ist die Enzymaktivität vergleichsweise gering.[3] Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.[4]

Cas12b aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.[3] Eine Verkürzung einer sgRNA um fünf Nukleotide am 5′-Ende verdreißigfacht die Enzymaktivität.[3] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.[3] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.[3]

Einzelnachweise

1. UniProt T0D7A2: cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene (uniprot.org) (englisch) 16. Oktober 2013, 24. Januar 2019
2. S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, F. Zhang, E. V. Koonin: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Molecular cell. Band 60, Nummer 3, November 2015, S. 385–397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008, PMID 26593719, PMC 4660269 (freier Volltext).
3. Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, Jonathan Schmid-Burgk, Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. In: Nature Communications. Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, doi:10.1038/s41467-018-08224-4, PMID 30670702.
4. L. Liu, P. Chen, M. Wang, X. Li, J. Wang, M. Yin, Y. Wang: C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism. In: Molecular cell. Band 65, Nummer 2, Januar 2017, S. 310–322, doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040, PMID 27989439.