Figlio d'arte, d'alta statura e fisionomia aristocratica[2], si diplomò all'istituto tecnico e si dedicò quindi alla recitazione esordendo come "brillante" d'operetta nella compagnia teatrale dello zio Attilio Pietromarchi; il passo verso il teatro di rivista fu breve e partecipò così agli spettacoli dei fratelli Schwarz e a quelli della compagnia di rivista Za-Bum.
Nel 1928 fu uno dei principali interpreti di Madama Follia e di Mille e una donna accanto a Totò e Isa Bluette, ma diventò ufficialmente la spalla di Totò dai primi anni quaranta ottenendo un successo personale in Quando meno te lo aspetti di Galdieri in cui recitava anche Anna Magnani. Venne riconfermato per la stagione successiva per uno dei più grandi successi di rivista di quel periodo, Volumineide, sempre di Galdieri e con i medesimi attori. Nel 1944 fu ancora con gli stessi attori e autore in Che ti sei messo in testa? e fu uno dei primi attori a festeggiare la liberazione di Roma e a prendere di mira attraverso la satira il caduto regime, sempre con Totò e la Magnani, in Con un palmo di naso.
Nel dopoguerra continuò ad affiancare Totò in teatro, soprattutto nella celebre rivista galdieriana C'era una volta il mondo (1947), con soubrette come Elena Giusti, Isa Barzizza e Gilda Marino.
Nel 1956 tornò in teatro debuttando da protagonista nella commedia di Marotta e Randone, Il malato per tutti, ottenendo un notevole successo personale e partecipando anche ad altri atti unici della stessa formazione diretta da Maner Lualdi e denominata "compagnia delle 15 novità". Nella stagione seguente fu scritturato dalla compagnia di Peppino De Filippo con buoni consensi soprattutto per la sua prestazione nella pièce Le metamorfosi di un suonatore ambulante (1957).
Come l'amico Totò,[3] che raggiunse il massimo grado, anche Mario Castellani fu iniziato nella Massoneria di Rito Scozzese.[4]
Nel 1967, poco prima della morte di Totò, Castellani gli fu di nuovo a fianco in una serie televisiva, TuttoTotò, diretta da Daniele D'Anza: uno spettacolo a episodi dedicato alla carriera del comico, in cui venivano riproposti gli sketch più celebri dei suoi spettacoli teatrali. Dopo la scomparsa del suo amico, Castellani diradò i propri impegni professionali. Negli ultimi anni apparirà quasi esclusivamente in televisione, soprattutto in rappresentazioni di commedie di Peppino De Filippo.
«Come amico ho il dovere di dire che questo fifone che si chiamava Totò era un uomo che la morte se la covava dentro con una specie di disperata tenerezza.[...] Gli ritornai accanto proprio a causa del suo male, perché mi resi conto che aveva bisogno di un amico che lo capisse a volo..»