La plupart des personnages qui ont déjà été présents dans l'opus précédent sont de retour, seule Toadette étant nouvelle. Il y a un total de 32 personnages jouables dans ce jeu, issus des séries Mario et Sonic. Les 20 personnages « principaux » (depuis l'opus Mario et Sonic aux Jeux olympiques d'hiver) sont jouables dans toutes les épreuves, tandis que certaines disciplines disposent de personnages « invités » exclusifs.
Le jeu reproduit plusieurs disciplines olympiques, divisées en trois catégories : les épreuves Tokyo 2020, qui reproduisent le cadre officiel et les sites locaux, les épreuves rêves où il s'agit de disciplines officielles mais réinventées dans un cadre de fantaisie et les épreuves Tokyo 1964, qui font appel au rétrogaming, le gameplay et les graphismes pastichant les jeux sur anciennes consoles (troisième et quatrième génération), les sprites des personnages sont directement repris des premiers jeux Sonic sur Megadrive et de Super Mario Bros. sur NES (et reflétant l'un des programmes des jeux de Tokyo en 2020 prévoyant de faire disputer des épreuves olympiques sur des sites qui ont déjà servi en 1964).
