EcoRI

EcoRI
Ідентифікатори
СимволEcoRI
Інші ідентифікаториPfam: F02963;
Інша інформація

EcoRI (читається «еко ер один») — ензим, ендонуклеаза рестрикції, виділена з бактерії E. coli, є частиною рестрикційно-модифікаційної системи бактерії.

У практичній молекулярній біології EcoRI використовується як рестриктаза. EcoRI розрізає дволанцюгову ДНК створюючи 4-нуклеотидний липкий кінець з виступаючим 5'-фрагментом AATT. ДНК-фрагментом, по якому відбувається розрізання, є шестинуклеотидний фрагмент GAATTC/CTTAAG.

Структура

Первинна структура

EcoRI містить амінокислотний мотив PD..D/EXK, який знайдений в активному сайті багатьох рестриктаз.

Кристалічна структура димеру EcoRI зв'язаного з ДНК (PDB 1ckq)

Третинна та четвертинна структура

Ензим утворює гомодимер з двох 31-кДа одиниць, кожна з яких є одним поліпептидним ланцюгом та існує у вигляді глобули з α/β архітектурою. Кожна одиниця в димері містить мотив-«петлю», яка виступає з глобули та зв'язується з ДНК-мішенню при розпізнаванні.[1][2]

EcoRI цільовий сайт. Зелена лінія вказує, як відбувається розрізання ДНК послідовності

EcoRI була закристалізована із ДНК-послідовністю, яку вона зазвичай розпізнає та розрізає (PDB код 1QPS). Аналіз кристалічної структури показав, що одиниці гомодимеру взаємодіють з ДНК симетричним чином.[1] Дві α-спіралі від кожної одиниці сходяться в просторі утворюючи специфічний «затискач».[3] На спіралях амінокислотні залишки Glu144 та Arg145 взаємодіють між собою, що ймовірно обумовлює фізичну комунікацію між активними сайтами обох одиниць.[4]

Мішень

EcoRI розрізає ДНК по паліндромному сайту GAATTC/CTTAAG із утворенням липких кінців. EcoRI є високоспецифічним ензимом, тобто навіть одинична заміна/перестановка нуклеотидів в сайті розпізнавання призводить до сильного зниження афінності рестриктази до цього сайту і як наслідок до втрати здатності розпізнавати і розрізати його. Бактерії використовують цю властивість для захисту власної ДНК від дії рестриктази: другий аденозин в послідовностях GAATTC в бактеріальному геномі є метильованим, внаслідок чого власна ДНК бактерії є стабільною в присутності рестриктази.[5]

Важливим фактором що обумовлює високу селективність рестриктази EcoRI до свого сайту розпізнавання є конформаційна жорсткість тривимірної структури білка. Внаслідок цього білок не може компенсувати збільшення енергії зв’язування через втрату багатьох водневих зв’язків конформаційною перебудовою для пошуків нових контактів у випадку неоптимальної послідовності ДНК.[5]

Застосування

Рестриктази, такі як EcoRI, широко використовуються в молекулярній біології та генетиці, в таких експериментальних процедурах, як, наприклад, молекулярне клонування. Рестриктази (в тому числі EcoRI) генерують липкі кінці, які можна потім сполучити за допомогою ДНК-лігаз. EcoRI може давати неспецифічні продукти рестрикції (star-активність), залежно від умов реакції, таких як низька іонна сила розчину, високий вміст гліцерину, надлишок ензиму, високі значення pH та наявність певних органічних розчинників.[6]

Див. також

Посилання

  1. ↑ а б Pingoud, A., Jeltsch, A. (2001). Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucl. Acids Res. Т. 29, № 18. с. 3705—3727. doi:10.1093/nar/29.18.3705. PMC 55916. PMID 11557805.
  2. ↑ Kurpiewski, M. R., Engler, L. E., Wozniak, L. A., Kobylanska, A., Koziolkiewicz, M., Stec, W. J, Jen-Jacobson, L (2004). Mechanisms of coupling between DNA recognition and catalysis in EcoRI endonucleases. Structure. Т. 12. с. 1775—1788. doi:10.1016/j.str.2004.07.016. PMID 15458627.
  3. ↑ Bitinaite, J., D. A. Wah, Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. (1998). FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. Т. 95, № 18. с. 10570—5. doi:10.1073/pnas.95.18.10570. PMC 27935. PMID 9724744.
  4. ↑ Kim, Y. C., Grable, J. C., Love, R., Greene, P. J., Rosenberg, J. M. (1990). Refinement of EcoRI endonuclease crystal structure: a revised protein chain tracing. Science. Т. 249, № 4974. с. 1307—1309. doi:10.1126/science.2399465. PMID 2399465.
  5. ↑ а б Gary D. Stormo. Sequence-specific interactions in protein-DNA complexes // Introduction to Protein-DNA Interactions: Structure, Thermodynamics, and Bioinformatics. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013. — P. 53–54. — ISBN 978-1-936113-50-7.
  6. ↑ Архівована копія. Архів оригіналу за 15 жовтень 2012. Процитовано 13 березень 2016.{{cite web}}: Обслуговування CS1: Сторінки з текстом «archived copy» як значення параметру title (посилання) [Архівовано 2012-10-15 у Wayback Machine.]