Первым владельцем Амбуазского замка был анжуйский граф Фульк Нерра. В Средние века городом обладало могущественное семейство Амбуазов, которые отсюда контролировали важный брод через Луару. В начале 1430-х гг. владелец замка был обвинён в заговоре против короля, а его владения изъяли в казну.
Нынешний трёхэтажный замок с циклопическими башнями по сторонам начал строиться в 1492 году по воле Карла VIII, который родился и умер в Амбуазе. Приглашённые им для завершения работ итальянцы Доменико да Кортона и фра Джокондо первыми принесли во Францию архитектуру ренессанса. Считается, что именно в Амбуазе появился первый за пределами Италии регулярный сад.
Франциск I вырос в Амбуазском замке, который принадлежал его матери Луизе Савойской, и благоволил ему более, чем Блуаской резиденции своего предшественника, Людовика XII. В 1515 году он поселил в имении Кло-Люсе (соединённом с замком подземным ходом) Леонардо да Винчи. Здесь он заканчивал «Джоконду», здесь же и умер в 1519 г. Похоронен художник, как принято считать, в замковой часовне св. Губерта (годы постройки 1491—1496).
После смерти Франциска I в Амбуазе обосновался «молодой двор» Генриха II и Екатерины Медичи. Здесь росли их дети и невестка, Мария Стюарт. В 1560 году Гизы привезли в Амбуаз из Блуа молодого короля Франциска II, на которого планировалось нападение гугенотов (см. Амбуазский заговор). Здесь же над заговорщиками была учинена жестокая расправа.
В годы Французской революции значительная часть Амбуазского замка была уничтожена. Чтобы остановить процесс расхищения культурных сокровищ, Третья республика в 1872 году предоставила сохранившиеся части замка в распоряжение Орлеанского дома. В настоящее время им ведает фонд Людовика Святого во главе с Его высочеством графом Парижским.
Во время Второй мировой войны и оккупации Франции террасы замка использовались для расположения немецкой системы ПВО для отражения воздушных атак союзников[2]. Причинение ущерба и характер повреждений в этот период выясняется по старым фотографиям замка..