Antonio Di Natale zawodową karierę rozpoczynał w 1996 roku w Empoli FC. Rozegrał dla niego jednak tylko 1 spotkanie, po czym był wypożyczany do innych zespołów. Sezon 1997/1998 spędził w Iperzoli Ponteroncariale, natomiast w kolejnych rozgrywkach reprezentował barwy 2 klubów – Varese oraz Esperia Viareggio. Dobra skuteczność w ostatniej z tych drużyn sprawiła, że Di Natale latem 1999 roku powrócił do Empoli. Sezon 1999/2000 zakończył z 6 trafieniami na koncie, jednak później prezentował już wyższą skuteczność. Podczas rozgrywek 2001/2002 włoski napastnik w ataku Empoli grał razem z Tommaso Rocchim oraz Massimo Maccarone. Ta trójka zawodników zdobyła łącznie 38 goli, co w dużym stopniu pomogło ekipie "Azzurich" awansować do Serie A. W pierwszej lidze Di Natale także prezentował dobrą skuteczność – strzelił 12 bramek i został najlepszym strzelcem Empoli.
Po spadku klubu do Serie B, w letnim okienku transferowym w 2004 roku Włoch podpisał kontrakt z Udinese Calcio. W ataku "Bianconerich" początkowo grał z Davidem Di Michele oraz Vincenzo Iaquintą, później do klubu zostali kupieni tacy zawodnicy jak Asamoah Gyan, Simone Pepe oraz Fabio Quagliarella. Udinese w sezonie 2004/2005 zajęło 4. lokatę w tabeli Serie A i zapewniło sobie awans do Ligi Mistrzów. W Champions League "Bianconeri" zajęli 3. miejsce w rundzie grupowej, przez co rozpoczęli rywalizację w Pucharze UEFA. W rozgrywkach Ligi Mistrzów Di Natale strzelił 3 bramki – wszystkie w dwumeczu z Werderem Brema, natomiast w Pucharze UEFA wpisał się na listę strzelców tylko w pojedynku przeciwko RC Lens.
Z sezonu na sezon włoski gracz strzelał coraz więcej goli w Serie A, a z czasem stał się kapitanem Udinese. Rozgrywki 2007/2008 zakończył z 17 trafieniami na koncie, co dało mu czwarte miejsce w klasyfikacji najlepszych strzelców ligi. W kolejnym sezonie z powodu kontuzji wystąpił tylko w 22 spotkaniach, w których strzelił 12 bramek. 7 lutego 2010 roku Di Natale strzelił hat-tricka w zwycięskim 3:1 meczu z SSC Napoli. W sezonie 2009/2010 w 35 występach zdobył łącznie 29 goli i został królem strzelców Serie A. Wyczyn ten powtórzył także w sezonie 2010/2011 zdobywając 28 goli w 36 meczach Serie A. 17 maja 2014 z dorobkiem 191 goli został 7. najskuteczniejszym strzelcem wszech czasów w Serie A, a 3 maja 2015 z 206 golami wyprzedził 6. Roberto Baggio. 25 sierpnia 2014 zdobył pięć bramek w wygranym 5:1 meczu Pucharu Włoch z Ternaną[1]. 23 listopada w meczu z Chievo Werona (1:1) zdobył swoją 200. bramkę w Serie A[2].
W maju 2008 roku Di Natale znalazł się w 23–osobowej kadrze powołanej na mistrzostwa przez Roberto Donadoniego. Na Euro Włosi zostali wyeliminowani w ćwierćfinale przez Hiszpanów, którzy wygrali 4:2 w rzutach karnych. Wychowanek Empoli podobnie jak Daniele De Rossi nie wykorzystał swojej jedenastki, a jego strzał obronił Iker Casillas. 6 września Di Natale zdobył oba gole dla Włochów w pierwszym meczu eliminacji do Mistrzostw Świata 2010 przeciwko Cyprowi i zapewnił swojej reprezentacji zwycięstwo. Na mundialu w 2010 roku wystąpił w trzech meczach grupowych przez łącznie 154 minuty, strzelając jedną bramkę w przegranym 3-2 meczu ze Słowacją 24 czerwca 2010, Włochy zakończyły turniej bez zwycięstwa na dnie grupy F.
Di Natale po dwóch latach przerwy w kadrze został powołany na Mistrzostwa Europy w 2012 r., gdzie Włochy zajęły drugie miejsce. W pierwszym meczu grupowym zmienił w 57. minucie Mario Balotelliego, by w 60. minucie strzelić swoją jedyną bramkę turnieju, w zremisowanym 1-1 starciu z reprezentacją Hiszpanii, była to jedyna bramka stracona przez Hiszpan w całych rozgrywkach. Do końca Euro wystąpił w pięciu z sześciu meczów kadry (bez ćwierćfinału z Anglią), tylko w meczu z Irlandią wychodząc w podstawowym składzie. W swoim ostatnim występie reprezentacyjnym – przegranym finale z Hiszpanią w Kijowie, pojawił się w drugiej połowie w miejsce Antonio Cassano.