Penelitian tentang optimasi proses diazotasi untuk penentuan Chloramphenicol secara Spektrofotometri UV-Vis telah dilakukan. Tujuan dari penelitian ini adalah membentuk garam diazonium dengan Sulfanilamid sebagai sumber garam diazonium dan direaksikan dengan asam nitrit diikuti dengan proses diazotasi serta dikopling dengan Chloramphenicol. Hasil penelitian ini adalah terbentuknya senyawa azo berwarna kuning jernih yang dapat diukur pada panjang gelombang 400,941 nm. Senyawa ini stabil apabila direaksikan pada temperatur di bawah 10°C. Kondisi optimum dapat diperoleh dengan melakukan proses diazotasi menggunakan 3 mL Sulfanilamid, 3 mL HCl dan 6 mL NaNO2 serta waktu pengoplingan untuk pembentukan senyawa azo selama 8 menit.   Kata Kunci: Chloramphenicol, Sulfanilamid, diazotasi, Spektrofotometri UV-Vis.