Umbi sarang semut (Myrmecodia pendans Merr. & Perry) memiliki aktivitas sitotoksik. Salah satu usaha pengawetan simplisia umbi sarang semut dilakukan dengan iradiasi gamma. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh iradiasi gamma pada sitotoksisitas dan profil kromatogram fraksi aktif dari umbi sarang semut. Serbuk kering umbi sarang semut diiradiasi gamma dengan beberapa macam dosis radiasi yaitu : 0 (kontrol); 5; 7,5; 10; dan 15 kGy. Percobaan dilakukan dengan dua kali ulangan untuk masing-masing dosis. Setelah iradiasi, serbuk dimaserasi bertahap berdasarkan tingkat kepolarannya dengan n-heksan, etil asetat, dan etanol. Setiap ekstrak diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel leukemia L1210. Dari hasil yang diperoleh didapatkan bahwa ekstrak etanol merupakan ekstrak yang paling aktif (IC50 9,88 μg/ml) dibandingkan ekstrak n-heksan (IC50 23,44 μg/ml) dan etil asetat (IC50 17,32 μg/ml). Ekstrak etanol dari masing-masing dosis difraksinasi secara kromatografi kolom menghasilkan 7 fraksi. Berdasarkan uji aktivitas sitotoksik fraksi-fraksi tersebut, fraksi 1 adalah fraksi yang paling aktif (IC50 ≤ 3,23 μg/ml ). Pada identifikasi KLT-densitometri dari fraksi 1 dan ekstrak etanol mengalami penurunan dan kenaikan bercak setelah diiradisi. Hasil kromatogram fraksi 1 dari KCKT menunjukkan bahwa puncak utama mengalami penurunan setelah diiradiasi. Dosis maksimum untuk iradiasi umbi sarang semut tanpa merusak aktivitas sitotoksiknya terhadap sel leukemia L1210 adalah 5 kGy. Kata kunci : iradiasi gamma, ekstrak dan fraksi etanol umbi sarang semut (Myrmecodia pendans Merr. & Perry), sel kanker Leukemia L1210, IC50, aktivitas sitotoksik, profil kromatogram.