Bakteri patogen yang resisten terhadap banyak obat  seperti Staphylococcus aureus yang kebal terhadap Methicillin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus/MRSA) telah menjadi agen penyebab infeksi baik di lingkungan pelayanan kesehatan maupun di masyarakat. Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) yang berasal dari mutasi β-laktamase juga menjadi masalah utama dalam infeksi terkait pelayanan kesehatan. Tujuan: Menentukan proporsi bakteri penghasil MRSA dan ESBL dari isolat klinis di Rumah Sakit Dr. M. Djamil Padang menggunakan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Metode: Penelitian ini merupakan studi prospektif dengan mengumpulkan isolat Staphylococcus aureus dan Enterobacteriaceae dari Juli hingga September 2017. Penelitian dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Andalas untuk mengkonfirmasi bakteri penghasil MRSA dan ESBL. Hasil: Sebanyak 15 dari 27 isolat Staphylococcus aureus (56%) merupakan  MRSA dan 21 dari 41 isolat Enterobacteriaceae (51%) adalah penghasil ESBL. Klebsiella sp. paling banyak ditemukan di antara isolat Enterobacteriaceae (59%). Lima puluh persen Klebsiella sp menghasilkan  ESBL. Simpulan: Studi ini menunjukkan bahwa setengah isolat klinis dari RSUP Dr. M. Djamil merupakan MRSA dan penghasil ESBL. Deteksi dini MRSA dan Enterobacteriaceae penghasil ESBL perlu dilakukan, untuk mencegah dan mengurangi transmisi bakteri MDR di lingkungan rumah sakit.Kata kunci: Enterobacteriaceae, Klebsiella sp, MDR, Staphylococcus aureus