Nata a Valley City, Dakota del Nord, sebbene frequentò la Central High School a Saint Paul in Minnesota (con compagno di classe Eddie Albert), Ann Sothern lasciò casa molto giovane e iniziò la sua carriera nel cinema con un'apparizione in Broadway Nights all'età di 18 anni. Durante il 1929 e il 1930 apparve anche come corista in Rivista delle nazioni e Whoopee!. Le sue doti vocali le consentirono di esibirsi a Broadway, dove nel 1931 fu protagonista di America's Sweetheart e Everybody's Welcome, e occasionalmente di cantare in alcuni film.
Nel 1934 la Sothern firmò un contratto di lavoro con la Columbia Pictures, che risolse ma due anni dopo. Nel 1936 fu scritturata dalla RKO Radio Pictures e, dopo una serie di film che non attirarono il pubblico, lasciò anche la RKO e fu scritturata dalla Metro-Goldwyn-Mayer, per la quale fece il suo primo film nel 1939, Maisie, in un ruolo originariamente destinato a Jean Harlow, quello della volgare ballerina di Brooklyn Mary Anastasia O'Connor. Dopo anni di gavetta, la Sothern riuscì finalmente a conquistare il vero successo, tanto che dal film verranno tratti sequel tra cui Congo Maisie (1940), Uncovered Maisie (1947) e Swing Shift Maisie (1943). Proprio per quest'ultimo lavoro i critici la definirono unanimemente come "una delle più brillanti attrici comiche nel settore".
Il 24 novembre 1941, Sothern recitò al Lux Radio Theatre nell'adattamento di Maisie was a Lady, e la notorietà conquistata dalla serie le consentì di essere scritturata per un proprio programma radiofonico, The Adventures of Maisie, andato in onda fino al 1953.
Nel 1949 recitò nel film Lettera a tre mogli, che ebbe eccellenti critiche ma che non diede ulteriori incentivi alla carriera artistica dell'attrice. Negli anni '50 prese parte a diversi film tra cui Gardenia blu (1953), per il quale ottenne recensioni positive, e anche in programmi televisivi. Nel 1953 riuscì a ottenere la parte da protagonista nella sitcom Private Secretary, che terminò nel 1957 a causa di una disputa tra Sothern e il produttore Jack Chertok. Successivamente interpreterà un'altra serie televisiva da protagonista, The Ann Sothern Show, dal 1958 al 1961. Entrambi gli show furono di grande successo e le fecero guadagnare quattro candidature al Premio Emmy.
Negli anni '60 la Sothern ebbe un attacco di epatite che danneggiò il suo aspetto; di conseguenza decise di non apparire più sullo schermo e la sua carriera fu progressivamente limitata a piccoli ruoli per il cinema e la televisione come in The Lucy Show e The Mothers-In-Law.
Continuò a lavorare di tanto in tanto per il piccolo schermo fino al 1984, anno in cui si ritirò a Ketchum (Idaho). Nel 1987 accettò il ruolo di Tisha, vicina di casa di due sorelle più anziane interpretate da Lillian Gish e Bette Davis, in Le balene d'agosto. L'acclamata performance le fece ottenere, per la prima volta in 60 anni di lunga carriera, la candidatura all'Oscar come miglior attrice non protagonista e all'Independent Spirit Awards nella medesima categoria. Nonostante il successo Le balene d'agosto fu il suo ultimo film, poiché l'attrice si ritirò definitivamente dalle scene trascorrendo la vecchiaia a Ketchum, dove morì il 15 marzo 2001, a 92 anni, per insufficienza cardiaca.
Ann Sothern è stata sposata con l'attore Roger Pryor, da cui divorziò il 17 maggio 1943. Meno di una settimana dopo sposò l'attore Robert Sterling, da cui ebbe una figlia, Tisha Sterling, e da cui divorziò 6 anni dopo.
