Léopold III est le fils aîné du prince Léopold II d'Anhalt-Dessau (1700-1751) et de son épouse Gisèle-Agnès (1722-1751), fille du prince Léopold d'Anhalt-Köthen. Lorsque son père décède prématurément, en 1751, son oncle Thierry assure la régence sur la principauté d'Anhalt-Dessau jusqu'à sa majorité, en 1758. Au cours de son Grand Tour, il entreprend beaucoup de voyages d'études, avant tout, à l'Italie, la France, la Suisse, les Pays-Bas et l'Angleterre.
Fidèle à la tradition de sa famille, notamment de son grand-père Léopold, il entre dans l'armée prussienne et devient le commandant d'un régiment à Halle. Comme son oncle Maurice, il participe à la guerre de Sept Ans dans les rangs de l'armée du roi Frédéric II de Prusse. Influencé par les conséquences de la bataille de Kolin, le , il déclare néanmoins que son état de santé l'oblige à renoncer à la carrière des armes pour se consacrer à l'administration de sa principauté. En échange il s'oblige à payer une contribution de 180 000 thalers provenant de sa fortune privée. En 1769, Frédéric II le fait chevalier de l’ordre de l’Aigle noir.