Ascacíbar schloss sich 2006 der Jugend von Estudiantes de La Plata an. Zum Beginn des Jahres 2016 wurde er in die erste Mannschaft des Klubs aufgenommen. Daraufhin gab er am 8. Februar 2016 im Spiel gegen CA Lanús sein Debüt in der Primera División.
Am 22. August 2017 wechselte Santiago Ascacíbar zum in die Bundesliga aufgestiegenen VfB Stuttgart und unterzeichnete einen Fünfjahresvertrag.[1] Ascacíbar verlängerte seinen Vertrag mit dem VfB am 9. August 2018 um ein weiteres Jahr bis Ende Juni 2023.[2] Mit dem VfB stieg er am Ende der Saison 2018/19 in die zweite Bundesliga ab.
Nach 13 Hinrundeneinsätzen (1 Tor) verließ der Argentinier den VfB innerhalb der Winterpause und unterschrieb einen bis 2024 gültigen Vertrag beim Bundesligisten Hertha BSC.[3]
Zur Saison 2022/23 wechselte Ascacíbar für ein Jahr auf Leihbasis in die italienischeSerie A zur US Cremonese; der Aufsteiger erhielt zudem eine Kaufoption.[4] Nach 13 Ligaeinsätzen wurde die Leihe im Januar 2023 vorzeitig beendet und Ascacíbar kehrte zu Estudiantes de La Plata zurück. Er wurde zunächst ausgeliehen, anschließend besteht eine Kaufoption.[5]