Der Río Espíritu Santo entspringt am Nordrand der Serranía de Callejas in einer Höhe von 2720 m im Municipio Villa Tunari in der Provinz Chapare. Der Fluss fließt auf den ersten dreißig Kilometern im Wesentlichen in nördlicher Richtung und schwenkt dann für den Rest des Laufes in östliche Richtung um. Er verlässt das Municipio in seinem gesamten Verlauf nicht und vereinigt sich nach insgesamt 66 Kilometern auf einer Höhe von 287 m mit dem Río San Mateo zum Río Chapare.