Gegen den Widerstand des Breslauer Domkapitels und der schlesischen Fürsten erhielt Johannes mit Einsatz von Geld und familiären Beziehungen die Stelle eines Koadjutors in Breslau. Zugleich wurde ihm die Nachfolge auf dem Bischofsstuhl zugesichert, die 1503 auch vom Papst bestätigt wurde. Obwohl der sogenannte „Kolowratsche Vertrag“ vom 3. Februar 1504 bestimmte, dass auf den Breslauer Bischofsstuhl künftig nur gebürtige Schlesier, Mährer, Böhmen oder Lausitzer gewählt werden dürfen, wurde Johannes Thurzo als Landfremder nach dem Tode des Bischofs Johann IV. Roth am 2. Februar 1506 dessen Nachfolger. Die Bischofsweihe erfolgte durch Johanns jüngeren Bruder Stanislaus Thurzo, der Bischof von Olmütz war.
Als Bischof von Breslau stand Johannes 1507–1509 als Oberlandeshauptmann an der Spitze der schlesischen Fürsten. Gemeinsam mit seinem Bruder Stanislaus übernahm er die Einsammlung der für den Neubau des Petersdoms in Rom bestimmten Ablassgelder in Böhmen, Mähren und Schlesien.
Seine Amtsführung war von dem schwierigen Verhältnis zum Domkapitel, das ihm Nachlässigkeit, schlechte Verwaltung und kostspielige Hofhaltung vorwarf, und von der kirchen- und klerusfeindlichen Stimmung der Breslauer Bürgerschaft und der schlesischen Landesfürsten geprägt. Es gelang ihm nicht, die schwierigen kirchenpolitischen Aufgaben, die sich aus der beginnenden Reformation ergaben, zu lösen. Obwohl er mehrere Diözesansynoden berief und 1512 die Diözesanstatuten drucken ließ, konnte er das religiöse Leben nicht entscheidend fördern und erneuern.
Thurzo besaß eine ansehnliche Bibliothek und zahlreiche Kunstwerke, darunter solche von Albrecht Dürer und Lucas Cranach. Durch seine rege Bautätigkeit förderte er die Bildenden Künste. Während seiner Amtszeit wurde die bischöfliche Sommerresidenz Burg Johannesberg bei Jauernig zu einem Renaissanceschloss umgebaut, und der Breslauer Dom erhielt einen kostbaren Reliquienschrein sowie ein Kupferdach. Mit dem von ihm 1517 errichteten Portal zur Domsakristei mit der Enthauptung Johannes des Täufers, hielt die Renaissancekunst Einzug in die Stadt. Er erbaute die Breslauer Dom#ChorkapellenJohanniskapelle und fand dort seine letzte Ruhestätte. Das Grabdenkmal aus weißem Marmor wurde 1537 von seinen Brüdern Stanislaus und Hans gestiftet.