Abad ke-21 meningkatkan daya saing internasional sehingga siswa perlu dibekali keterampilan dengan berbagai kompetensi yang dibutuhkan. Salah satu keterampilan yang dibutuhkan di era globalisasi adalah keterampilan berpikir kritis. E-book interaktif merupakan bahan ajar berbentuk digital yang bersifat aktif (didesain agar dapat melakukan perintah balik kepada pengguna) dengan mengkombinasikan teks, gambar, video, suara, dan animasi, serta pertanyaan yang dapat dijawab secara langsung oleh siswa. Tujuan penelitian ini adalah mendeskripsikan validitas dari e-book interaktif pada materi keanekaragaman hayati untuk melatihkan keterampilan berpikir kritis siswa kelas X SMA. Jenis penelitian ini adalah pengembangan dengan menggunakan model 4D (define, design, develop, disseminate) namun tahap disseminate tidak dilakukan. Teknik pengumpulan data dilakukan dengan metode validasi dan dianalisis dengan metode deskriptif kuantitatif. Hasil validasi dinyatakan sangat valid dengan persentase rata-rata kelayakan penyajian 100%, kelayakan isi 100%, dan kelayakan kebahasaan 100%. Berdasarkan tiga kriteria kelayakan tersebut diperoleh rata-rata persentase keseluruhan 100% menunjukkan kategori sangat valid. Pada e-book interaktif terdapat beberapa fitur utama dan pengayaan yang disertai dengan uraian soal dan memuat enam indikator berpikir kritis (interpretasi, analisis, inferensi, evaluasi, eksplanasi, dan regulasi diri) yang harus dijawab oleh siswa, sehingga e-book interaktif pada materi keanekaragaman hayati ini dapat melatihkan keterampilan berpikir kritis siswa. Kata Kunci: Validitas, e-book interaktif, keanekaragaman hayati, keterampilan berpikir kritis.