Penyakit tuberculosis (TB) paru membutuhkan pengobatan secara tuntas, karena dapat menyebabkan komplikasi yang berujung pada kematian. TB Paru merupakan masalah kesehatan yang dihadapi dalam dunia global. Pengetahuan yang baik apabila tidak ditunjang dengan sikap positif yang diperlihatkan akan mempengaruhi seseorang untuk berperilaku. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui hubungan antara tingkat pengetahuan keluarga tentang TB Paru dengan penggunaan masker medis di Wilayah Kerja Puskesmas Ngesrep, Gajah Mungkur, Semarang. Penelitian ini menggunakan desain deskriptif analitik dengan rancangan cross sectional. Sampel penelitan berjumlah 70 responden yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi dengan teknik purposive sampling. Data diperoleh dengan menggunakan kuesioner tingkat pengetahuan dan kuisioner penggunaan masker medis. Analisa data menggunakan uji chi-square. Tingkat pengetahuan tentang TB Paru di wilayah Puskesmas Ngesrep Gajah Mungkur, Semarang, dengan kategori baik 37% (26 responden), tingkat pengetahuan sedang sebesar 36% (25 responden), dan tingkat pengetahuan buruk sebesar 27% (19 responden). Perilaku penggunaan masker pada keluarga di wilayah Puskesmas Ngesrep Gajah Mungkur Semarang, dengan kategori baik sebesar 37,1% (26 responden), perilaku penggunaan masker sedang sebesar 30% (21 responden), dan perilaku penggunaan masker buruk sebesar 32,9% (23 responden). Terdapat hubungan tingkat pengetahuan dengan perilaku penggunaan masker di wilayah Puskesmas Ngesrep Gajah Mungkur Semarang, dengan nilai p value< 0,043.